中國漢族人群SNPH 基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究

巫 珺 陸佳晶 黃欣欣 黃茹燕 呂欽諭，△ 易正輝，

（1上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心精神科 上海 200030；2復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院精神科 上海 200040；3上海市虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心精神科 上海 200083）

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一種復(fù)雜的精神疾病，據(jù)估計全球有2 100 萬人患有SZ，給社會與個體帶來了極大的負擔［1］。SZ 臨床癥狀復(fù)雜，以陽性癥狀、陰性癥狀、認知功能損害作為主要核心癥狀，并伴隨有情感障礙、意志行為障礙等其他臨床表現(xiàn)［2-3］。目前認為SZ 起病受到遺傳、生物和環(huán)境因素的交互影響。其中SZ 的神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)假說是目前最為重要的假說。而神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)涉及多種蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)和動態(tài)的相互作用。其中，可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）蛋白的復(fù)合物起著核心作用［4-5］。SNARE 復(fù)合蛋白或其調(diào)節(jié)因子的變化能夠影響囊泡的募集、對接、膜融合和再循環(huán)［6］，進而影響SZ 患者關(guān)鍵腦區(qū)不同神經(jīng)遞質(zhì)的突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］，影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，最終參與SZ 的發(fā)生［8-9］。

伸展蛋白（syntaphilin，SNPH）是SNARE 蛋白的重要調(diào)節(jié)因子。SNPH 蛋白在大腦特異性表達，特別是影響突觸可塑性的區(qū)域表達豐富。其表達啟動于嗜鉻細胞分裂細胞系（pheochromocytomaderived cell line，PC12）細胞的神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)，并分化為兩個細胞亞群，分別以線粒體外膜和突觸質(zhì)膜為靶點［10］。已知SNARE 復(fù)合蛋白是由突觸融合蛋白-1、突觸小泡蛋白以及突觸相關(guān)蛋白 25（synaptosomal associated protein 25，SNAP-25）相互作用而形成。SNPH 蛋白能夠在膜融合階段與SNAP-25 競爭性結(jié)合游離的突觸融合蛋白-1，來抑制SNARE 復(fù)合體的形成。體外實驗顯示，對于培養(yǎng)基中的海馬神經(jīng)元，SNPH 蛋白的瞬時過表達顯著減少了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，而將SNPH 蛋白引入突觸前頸上神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元則可抑制突觸傳遞。總之，SNPH 蛋白能夠作為一個分子鉗，抑制SNARE復(fù)合體的裝配，來調(diào)節(jié)突觸囊泡的胞排作用［11］。并且蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化可以作為SNPH 蛋白的“關(guān)閉”開關(guān)，通過環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑阻斷其與突觸融合蛋白-1 的結(jié)合，抑制SNPH 蛋白的功能，說明SNPH的調(diào)節(jié)功能具有動態(tài)平衡［12］。并且，SNPH 蛋白也與神經(jīng)退行性變存在關(guān)聯(lián)［13］。也有證據(jù)顯示，SZ 患者血漿神經(jīng)源外泌體提取液中線粒體的SNPH 蛋白顯著高于健康對照組［14］，提示SNPH 蛋白參與SZ 發(fā)生的途徑具有多樣性。

SNARE 復(fù)合體與多種精神疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，除SZ 外尚包括雙相情感障礙、注意缺陷多動障礙等［15-16］。因此，作為SNARE 復(fù)合體的重要抑制因子，SNPH基因可作為SZ 的候選基因。目前尚無SNPH基因多態(tài)性是否與SZ 存在關(guān)聯(lián)的相關(guān)報道。因此本研究假設(shè)SNPH基因多態(tài)性與SZ 發(fā)生存在關(guān) 聯(lián)。 我 們 選 取SNPH基 因 的 5 個 位 點（rs3764714、 rs3795139、 rs3803947、 rs3803949、rs6134520）進行多態(tài)性檢測，通過病例對照的關(guān)聯(lián)分析來探討SNPH基因多態(tài)性與中國漢族人群SZ發(fā)生的關(guān)聯(lián)性，以進一步明確SNPH基因與SZ 多態(tài)性的關(guān)系。

資料和方法

病例組本研究共納入SZ 患者389 例，來源于2015 年9 月至2018 年9 月在上海交通大學醫(yī)院院附屬精神衛(wèi)生中心住院或門診患者。入組標準：（1）符合《國際疾病分類》第10 版（ICD-10）SZ 的診斷標準；（2）年齡小于65 歲；（3）漢族人群；（4）患者本人及其監(jiān)護人簽署知情同意書。排除標準：（1）目前或既往符合ICD-10 中除SZ 以外的其他精神疾病患者；（2）具有明顯的自殺、自殘及危害他人傾向的患者；（3）有嚴重軀體疾病的患者；（4）存在物質(zhì)及藥物濫用者。

對照組本研究共納入正常對照433 例，來源于廣告招募的社區(qū)志愿者。入組標準：（1）年齡小于65 歲；（2）漢族；（3）簽署知情同意書；（4）健康者與患者無血緣關(guān)系。排除標準：（1）有精神疾病及精神疾病家族史；（2）有嚴重軀體疾病史；（3）孕婦和哺乳期婦女。

本研究獲上海市精神衛(wèi)生中心倫理審查委員會批準（批件號：2017-19R）。

SNP 位點的選擇SNPH基因數(shù)據(jù)從千人基因組 數(shù) 據(jù) 庫（http：//grch37.ensembl.org/index.html）中查到并下載，使用HaploView 軟件以及SNP 在線網(wǎng) 站（http：//gvs.gs.washington.edu/GVS150/）篩選 標 簽SNP（tag SNPs），針 對SNPH基 因（NC_000020.11，chr1：1266292～1309327）及 基 因 上 游2 000 bp，以連鎖不平衡系數(shù)（r2）＞0.8，微小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 的原則進行挑選，共挑選出5 個標簽SNPs，即rs3764714［chr20：1306461（GRCh38.p12）］，rs3795139［chr20：1305289（GRCh38.p12）］，rs3803947［chr20：1308322（GRCh38. p12）］ ，rs3803949 ［chr20：1308693（GRCh38. p12）］ ，rs6134520 ［chr20：1307579（GRCh38.p12）］。其中rs3795139 位于外顯子區(qū)域。rs3764714、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位于3’端UTR 區(qū)。

由于不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的頻率出現(xiàn)。在某一群體中，不同座位某兩個等位基因出現(xiàn)在同一條染色體上的頻率高于預(yù)期的隨機頻率的現(xiàn)象，稱為連鎖不平衡。應(yīng)用HaploView 4.2 軟 件 對SNPH基 因5 個SNP 位 點 進行連鎖不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），單倍型頻率＜3.0%將不被納入后續(xù)分析。以D’值來衡量各位點之間的連鎖不平衡程度，建議D’＞0.8可以構(gòu)成一個單倍型區(qū)塊。分析結(jié)果顯示：SNPH基因的rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 5 個SNP 位點可以構(gòu)成一個單倍型區(qū)塊（圖1）。

圖1 5 個SNPs 的連鎖不平衡分析結(jié)果Fig 1 Results of linkage disequilibrium analysis of 5 SNPs loci

DNA 提取抽取病例組及對照組人群外周靜脈血5 mL，置于EDTA 抗凝管中抗凝，采用血液基因組DNA 提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）提取全血DNA 后，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

基因型檢測應(yīng)用TaqMan 熒光探針基因分型技術(shù)對rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位點的SNP 進行檢測。TaqMan SNP Genotyping Assays 試 劑 盒 、TaqMan SNP Genotyping Mix 試劑盒及PCR 擴充應(yīng)用7900 HT熒光實時定量PCR 儀購自美國ABI 公司。PCR 擴增反應(yīng)體系為5 μL，包括2×Taqman Master Mix 試劑2.0 μL，40×Taqman Genotyping Assay 試 劑0.05 μL，DNA（15～20 ng/μL）2 μL，H2O 0.95 μL。PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃10 min 預(yù) 變 性；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共進行50 個循環(huán)，每例樣本均重復(fù)檢測3 次。 采 用 SDS version 2.1 軟 件 中 Allelic Discrimination 程序進行基因分型，通過檢測不同等位基因FAM 和VIC 熒光強度來判斷樣本的基因型，并將結(jié)果保存。

統(tǒng)計學方法選擇位點前，使用SPSS 26.0 對病例組和對照組一般人口統(tǒng)計學資料進行比較，其中計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料應(yīng)用獨立樣本t檢驗。并使用Haploview 統(tǒng)計軟件進行兩兩位點之間的LD，用D’值來度量各個位點間的連鎖不平衡程度。選擇位點后，應(yīng)用在線SHEsis 軟件（http：//analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm）進行單個位點的關(guān)聯(lián)分析（等位基因、基因型頻率的比較）及位點之間的單倍型分析，通過計算比值比（odds ratio，OR）與95%CI 以了解等位基因和疾病的關(guān)聯(lián)強度（OR＞1 是危險因素；OR＜1 是保護因素），并對各組間基因型頻率分布進行H-W 平衡吻合度檢驗。采用SNPstats（https：//www.snpstats.net/snpstats/start.htm）在線軟件對不同位點的遺傳模式進行分析。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果采用Bonferroni進行校正檢驗，即每個SNP 的P值乘以所分析的遺傳標記數(shù)目，以校正后的P＜0.05表示位點與疾病之間的關(guān)聯(lián)有顯著性。

應(yīng)用Quanto 1.2.4 軟件進行計算樣本的統(tǒng)計效能，5 個SNP 中rs3764714 的微小等位基因頻率（MAF=0.056）最小。假設(shè)OR=1.5，加性模式為參考，疾病一般人群患病率為1%，病例組389 例，對照組433 例，計算結(jié)果顯示：統(tǒng)計效能為0.99。

其中，在線Shesis 軟件主要具備3 種分析功能，首先可以進行單位點分析，以進行等位基因頻率和基因型頻率統(tǒng)計為主，其次可對位點進行兩兩D’和r2的計算，最后可以對單倍型進行分析。 而SNPstats 是一個從遺傳流行病學的角度設(shè)計的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用程序，能夠進行關(guān)聯(lián)分析。Quanto 1.2.4 軟件是一個計算效能或所需樣本大小的程序，用于基因、環(huán)境因素、基因-環(huán)境（G×E）相互作用或基因-基因（G×G）相互作用的關(guān)聯(lián)研究。使用各個軟件時均按照軟件要求進行數(shù)據(jù)編碼。

結(jié) 果

一般人口學資料病例組共389 例，其中男性208 例（53.5%），女性181 例（46.5%）；年齡13～65歲，平均（36.74±18.27）歲。正常對照組共入組433例，其中男性224 例（51.7%），女性209 例（48.3%）；年齡17～64 歲，平均（36.22±13.00）歲。病例組與對照組性別（χ2=0.329，P=0.566）和年齡（t=0.473，P=0.636）差異均無統(tǒng)計學意義。

Hardy-Weinberg 平衡檢驗5 個位點（rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520）在病例組和對照組中均符合H-W 平衡（P＞0.05），可以被納入后續(xù)的分析。

SNPH基因5 個位點等位基因和基因型分布的比較結(jié)果表明，病例組（SZ 組）與對照組（HC 組）中 5 個 SNP （rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520）等位基因及基因型分布差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 病例組與對照組等位基因和基因型比較Tab 1 Comparison of allele frequencies and genotype frequencies of case group and control group

不同遺傳模式下基因型分布比較在共顯性、隱性、顯性及加性遺傳模式下，病例組與對照組rs3764714、 rs3795139、 rs3803947、 rs3803949、rs6134520 基因型分布差異均無統(tǒng)計學意義（表2，其中加性模式為參考）。

表2 病例組與對照組不同遺傳模式下基因型的比較Tab 2 Comparison of genotype distribution in different models between case group and control group

病例組與對照組的單倍型分析應(yīng)用SHEsis 在線軟件對病例組（SZ 組）及對照組（HC 組）間單倍型進行 分 析，發(fā) 現(xiàn) 由rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位點組成的單倍型A-A-A-C-T，G-A-G-T-T，G-G-G-C-C頻率＞3%，后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)3個單倍型在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學意義（表3）。

表3 病例組與對照組單倍型分布的比較（rs3764714，rs3795139，rs3803947，rs3803949，rs6134520）Tab 3 Comparison of Haplotype distribution of case group and control group（rs3764714，rs3795139，rs3803947，rs3803949，rs6134520）

討 論

SZ 的神經(jīng)遞質(zhì)假說是目前用以解釋SZ 發(fā)病原因的主流觀點，而SNARE 復(fù)合體對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程起著關(guān)鍵作用，并最終影響SZ 的發(fā)生發(fā)展。因此，作為SNARE 復(fù)合體組裝的抑制因子，SNPH蛋白同樣在神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過程中扮演著重要的角色，SNPH基因可作為SZ 遺傳學研究的候選基因之一而受到關(guān)注。

在本研究中，5 個位點在病例組和對照組中均符合H-W 平衡，可以進行下一步分析。而病例組和對照組在年齡與性別方面差異均無統(tǒng)計學差異，數(shù)據(jù)較為匹配。根據(jù)統(tǒng)計效能檢驗，本研究統(tǒng)計效能為0.99，統(tǒng)計效能較好。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群SZ 患者和健康人群之間，SNPH基因5 個SNP位 點（rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520）等位基因及基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義。在共顯性、隱性及加性遺傳模式下，兩組之間5 個SNP 位點基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義。這表明該基因的多態(tài)性可能與SZ 的發(fā)生沒有關(guān)聯(lián)，其特定的等位基因或者基因型可能不會導(dǎo)致SZ 的發(fā)病風險增加。針對SNPH基因5 個SNP 位點進行的連鎖不平衡分析顯示，該5 個位點可構(gòu)成一個單倍型區(qū)塊（D’＞0.8）。然而，在單倍型 分 析 中，由rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位點組成的單倍型A-A-A-CT、G-A-G-T-T和G-G-G-C-C頻率分布在病例組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.978、0.535、0.524），說明這3 種單倍型可能不會增加SZ 的發(fā)病風險。本研究結(jié)果顯示，在中國漢族人群中SNPH基因可能不是SZ 發(fā)生的易感基因。

本研究選取的SNPH5 個SNP 位點在SZ 相關(guān)研究中均未見報道，但有研究顯示，SNPH 蛋白與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。首先，SNPH 蛋白可能與腦白 質(zhì) 病 變（white matter lesions，WMLs）有 關(guān)［17］。WMLs 是一種伴有脫髓鞘和認知功能下降的腦血管疾病。其次，體外實驗證實，樹突中SNPH過度表達會誘導(dǎo)N-甲基-D-天冬氨酸興奮毒性、減少線粒體鈣攝取和阻止線粒體自噬，導(dǎo)致線粒體功能的損害，最終與神經(jīng)退行性疾病多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）相關(guān)［18］?？梢奡NPH 蛋白在大腦的結(jié)構(gòu)與功能中具有一定的調(diào)節(jié)作用。但是對于同樣伴隨有認知功能下降的SZ，SNPH 蛋白作為其神經(jīng)遞質(zhì)假說中的重要中介因素，相關(guān)的研究卻極少，因此本研究具有一定的創(chuàng)新性和開拓性。

本研究在以下幾個方面具有局限性。首先，所選5 個點屬于一個區(qū)塊，進行基因型分析時可能由于LD 的存在而造成混雜。候選基因法選點時應(yīng)考慮編碼SNPs（cSNPs），即在基因上首先考慮CDS區(qū)域（外顯子）及啟動子等，本研究選點時在編碼SNPs（cSNPs）上考慮不足。多個位點位于3′UTR區(qū)，且僅1 個SNP 在外顯子上，本研究對功能SNPs的探究不足。雖然3′-UTR 區(qū)可能在生物復(fù)雜性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，但更多3′-UTR 區(qū)的SNPs 高度保守，編碼區(qū)的SNPs 功能普遍更為重要。其次，僅選取了SNPH基因的5 個SNP 位點進行關(guān)聯(lián)分析，即使這5 個位點是經(jīng)過篩選得到的，也不足以反映SNPH基因的全部信息，在后續(xù)研究中需擴大進行關(guān)聯(lián)分析的SNP 位點規(guī)模，以進一步探索SNPH基因的相關(guān)信息。此外，本研究僅僅初步探討了SNPH基因多態(tài)性與SZ 的相關(guān)性，該基因多態(tài)性與SZ 相關(guān)受體、遞質(zhì)、蛋白的關(guān)聯(lián)，以及其他基因與SNPH之間的相互作用需要進一步研究，以明確SNPH基因多態(tài)性在SZ 發(fā)生機制中的作用。進一步驗證SNPH基因多態(tài)性與SZ 的關(guān)聯(lián)需要設(shè)計更加嚴謹?shù)膶嶒灧桨?，增加樣本量，保證入組患者的同質(zhì)性，進行重復(fù)性實驗。

作者貢獻聲明巫珺 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，病例收集，數(shù)據(jù)采集，基因分型。陸佳晶 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，論文撰寫。黃欣欣，黃茹燕 病例收集，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。呂欽諭，易正輝 數(shù)據(jù)分析，論文構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。