Duchenne型肌營養(yǎng)不良患兒抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合物的表達(dá)及臨床意義

王燕，趙斯鈺，李霞，楊樂

（西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710002）

Duchenne 型肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是目前常見的X 連鎖隱性遺傳性肌病類型，可出現(xiàn)近端肌無力、肌萎縮等表現(xiàn)，且下肢肌無力重于上肢，患兒的癥狀多呈進(jìn)行性加重。據(jù)調(diào)查[1]，活產(chǎn)男嬰中DMD 的發(fā)病率約為1/3 500，女嬰一般為致病基因攜帶者，罕見發(fā)病。一旦發(fā)生DMD，患兒可在3～5 歲時出現(xiàn)走路姿勢異常、跑跳慢、容易跌倒、上下樓梯困難等情況，若未及時發(fā)現(xiàn)和治療，很可能會隨著病程的延長出現(xiàn)雙腓腸肌假性肥大、“鴨步”步態(tài)，Gower 征陽性，對其日常生活和身心健康造成嚴(yán)重的危害[2]。DMD 為X 連鎖、隱性、致死性遺傳病，主要由編碼抗肌萎縮蛋白（Dystrophin）DMD 基因的突變導(dǎo)致肌細(xì)胞膜上的骨架蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變致病[3]?？辜∥s蛋白-糖蛋白復(fù)合物（dystrophinglycoprotein complex, DGC）被證實[4-5]在肌纖維和肌膜反復(fù)運動過程中具有保護(hù)作用，主要包括肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖（α-DG、β-DG）、肌聚糖蛋白（α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG）、互生蛋白（Syntrophin）等，而其異常表達(dá)可引起肌營養(yǎng)不良，導(dǎo)致骨骼肌離心運動承載高張力傳遞狀態(tài)。關(guān)于DMD 患兒DGC的表達(dá)及其臨床意義鮮有報道，鑒于此，本研究對DMD 患兒與未患DMD 小兒的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，以期為DMD 患兒的臨床治療方案研究提供方向，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2015年1月—2019年8月西安市兒童醫(yī)院收治的56 例DMD 患兒的臨床資料，記為DMD 組；另選取同期本院收治的52 例經(jīng)腓腸肌病理檢查證實未患DMD 小兒的臨床資料，記為對照組。DMD 組患兒均為男性；腓腸肌病理檢查年齡6 個月～12 歲，平均（5.41±1.02）歲；病情分級：1級2例、2級5例、3級10例、4級12例、5級11例、6級10 例、7 級6 例；病理檢查均呈肌營養(yǎng)不良改變。對照組患兒也均為男性；腓腸肌病理檢查年齡6 個月～12 歲，平均（5.20±1.08）歲；病理檢查無異常；疾病類型：囊腫40 例、其他12 例。兩組基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬知情并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①DMD 組經(jīng)腓腸肌病理檢查證實為DMD 患兒[6]；②對照組經(jīng)腓腸肌病理檢查證實未患DMD，如骨折、囊腫；③年齡≤12 歲；④保存有腓腸肌組織；⑤有完整的資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他類型骨骼/肌肉疾病者，如骨髓炎、急性肌肉萎縮或肌肉神經(jīng)痛等；②其他部位發(fā)育畸形或功能障礙者；③其他原因引起的肌力下降、步態(tài)異常者，如小兒腦癱、癲癇等；④轉(zhuǎn)院或失訪者。

1.2 儀器與試劑

冷凍組織切片機(jī)購自德國徠卡生物系統(tǒng)有限公司，熒光顯微鏡購自上海賴氏電子科技有限公司。鼠抗人Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG、Syntrophin 單克隆抗體，以及兔抗鼠Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG、Syntrophin 多克隆抗體（被過氧化物酶標(biāo)記）均購自上海澤葉生物科技有限公司，過氧化氫-甲醛溶液購自上海澤葉生物科技有限公司，山羊血清購自上海愛必信上海生物科技有限公司，甘油-磷酸鹽緩沖液均購自上海賴氏電子科技有限公司，染色試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 研究方法

采用免疫熒光染色法檢測Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 表達(dá)水平。常規(guī)取腓腸肌組織，迅速冷凍后置于-80℃冰箱冷凍保存待檢，用冷凍組織切片機(jī)以8 μm 層厚連續(xù)切片，在丙酮中-20℃固定10 min，取過氧化氫-甲醛溶液（體積分?jǐn)?shù)3%）孵育30 min，組織切片用山羊血清（體積分?jǐn)?shù)10%）封閉30 min 后滴加鼠抗人Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 單克隆抗體，室溫孵育60 min，滴加兔抗鼠Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 多克隆抗體，室溫孵育30 min，甘油-磷酸鹽緩沖液封片后，熒光顯微鏡下觀察待檢測蛋白的表達(dá)情況。于100 倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取每張切片5 個不同視野，采用IPP 6.0軟件對陽性表達(dá)蛋白進(jìn)行定量分析，計算積分光密度（IOD）值，取5 個視野平均值作為最終數(shù)據(jù)。另對蛋白缺乏程度進(jìn)行分級評分，完全缺失/無表達(dá)為0 級，計0 分；少量殘存為1 級，計1 分；可見少數(shù)陽性纖維為2 級，計2 分；有表達(dá)但輕微減弱為3 級，計3 分；局部表達(dá)缺失或陽性、陰性表達(dá)鑲嵌式分布為4 級，計4 分。

DMD 組病情分級標(biāo)準(zhǔn)[7]：臨床前期血清肌酸激酶水平偏高，但肌力基本正常者為0 級；有正常步態(tài)、不能跑步且伴有肌肉萎縮者為1 級；足尖、足跟不能行走，鴨步步態(tài)者為2 級；肌力下降，需借助外力上樓者為3 級；Gower 征陽性者為4 級；蹲下后不能自主立起者為5 級；不能上臺階者為6 級；不能從椅凳上站起者為7 級；不能獨自平路行走者為8 級；不能獨坐并有吞咽功能障礙者為9 級。

1.4 觀察指標(biāo)

DMD 組和對照組Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 的IOD 值；DMD 組不同病情分級患兒Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG、Syntrophin 的IOD 值及缺乏程度分級；DMD 組Dystrophin 染色與α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 的相關(guān)性；DMD 組和對照組DGC 免疫熒光染色法的典型圖片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Dystrophin、DGC表達(dá)的IOD值比較

DMD 組和對照組Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 表達(dá)的IOD 值比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），DMD 組低于對照組。見表1。

表1 DMD組和對照組Dystrophin、DGC的IOD值比較 （±s）

表1 DMD組和對照組Dystrophin、DGC的IOD值比較 （±s）

組別DMD組對照組t 值P 值n 56 52 Dystrophin 146.37±22.58 562.96±63.07 52.080 0.000 α-DG 185.67±25.68 497.13±61.29 34.880 0.000 β-DG 124.83±22.17 569.74±68.97 45.810 0.000 α-SG 212.78±41.29 587.56±69.74 34.270 0.000 β-SG 142.47±20.95 571.57±62.63 48.450 0.000 γ-SG 195.42±22.67 559.75±71.87 36.060 0.000 δ-SG 181.59±21.66 541.69±72.56 35.490 0.000 Syntrophin 301.37±39.74 559.12±61.63 33.700 0.000

2.2 DMD組不同病情分級患兒Dystrophin、DGC表達(dá)的IOD值及缺乏程度分級比較

DMD 組不同病情分級患兒Dystrophin、α-DG、 β -DG、 α -SG、 β -SG、 γ -SG、 δ -SG 及Syntrophin 表達(dá)的IOD 值及缺乏程度分級比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。且每兩個亞組比較，經(jīng)SNK-q檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中病情分級<3 級患兒Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 表達(dá)的IOD 值及缺乏程度分級均高于3 ～5 級、> 5 級患兒，3 ～5 級患兒Dystrophin、α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 表達(dá)的IOD 值及缺乏程度分級均高于> 5 級患兒。見表2、3。

表2 不同病情分級患兒Dystrophin、DGC表達(dá)的IOD值比較 （±s）

表2 不同病情分級患兒Dystrophin、DGC表達(dá)的IOD值比較 （±s）

組別<3級3～5級>5級F 值P 值n7 33 16 Dystrophin 251.68±39.76 149.20±25.47 94.46±19.51 22.490 0.000 α-DG 236.87±23.51 184.32±27.89 166.05±24.16 17.610 0.000 β-DG 179.86±29.61 122.59±20.36 105.37±25.87 25.440 0.000 α-SG 289.77±42.36 212.81±36.71 179.04±44.50 18.930 0.000 β-SG 189.74±20.05 140.46±20.05 125.94±23.12 22.920 0.000 γ-SG 271.29±30.05 199.63±21.20 153.54±24.54 63.360 0.000 δ-SG 257.50±21.53 184.69±22.10 141.99±22.08 67.730 0.000 Syntrophin 389.67±41.47 300.58±40.63 264.37±37.10 24.200 0.000

表3 不同病情分級患兒Dystrophin、DGC缺乏程度分級評分的比較 （分，±s）

表3 不同病情分級患兒Dystrophin、DGC缺乏程度分級評分的比較 （分，±s）

組別<3級3～5級>5級F 值P 值n7 33 16 Dystrophin 2.51±0.44 1.85±0.35 1.70±0.25 11.250 0.000 α-DG 2.20±0.41 1.83±0.33 1.71±0.31 5.270 0.010 β-DG 2.45±0.41 2.11±0.37 1.81±0.30 8.430 0.000 α-SG 2.59±0.54 1.95±0.33 1.22±0.34 39.810 0.000 β-SG 2.54±0.31 1.90±0.35 1.60±0.30 19.510 0.000 γ-SG 2.89±0.50 2.08±0.40 1.67±0.37 22.210 0.000 δ-SG 2.97±0.41 2.11±0.41 1.71±0.33 25.550 0.000 Syntrophin 3.55±0.50 3.14±0.51 2.76±0.44 6.880 0.000

2.3 兩組DGC 免疫熒光染色法的典型圖片

兩組α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 免疫熒光染色的典型圖片見圖1～7，其陽性表達(dá)肌細(xì)胞膜上，可見薄且連續(xù)的、完整的環(huán)形熒光。

圖1 α-DG免疫熒光染色圖片 （×100）

圖2 β-DG免疫熒光染色圖片 （×100）

圖3 α-SG免疫熒光染色圖片 （×100）

圖4 β-SG免疫熒光染色圖片 （×100）

圖5 γ-SG免疫熒光染色圖片 （×100）

圖6 δ-SG免疫熒光染色圖片 （×100）

圖7 Syntrophin免疫熒光染色圖片 （×100）

2.4 DMD 患兒Dystrophin 染色與DGC 的相關(guān)性

DMD患兒Dystrophin染色與α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.712、0.756、0.782、0.714、0.796、0.743 和0.785，P=0.005、0.001、0.003、0.012、0.000、0.008 和0.009）。

3 討論

DMD 屬于基因突變所致，X 連鎖隱性遺傳，患兒多呈家族聚集性，也有超過30%的患兒是由于新的基因突變致病。有研究[8]認(rèn)為，DMD 患兒DGC 蛋白異常表達(dá)可影響大腦中樞組織結(jié)構(gòu)與功能，甚至可導(dǎo)致認(rèn)知、行為及智力障礙。有研究[9-10]證實，DMD 的基因缺陷定位在Xp21.2，Dystrophin表達(dá)減少，可導(dǎo)致DGC 蛋白異常表達(dá)從而影響纖維肌膜的穩(wěn)定性，使其在機(jī)械收縮過程中受損傷的風(fēng)險增加，而肌纖維膜外鈣離子可大量進(jìn)入肌纖維，增加其鈣離子濃度，誘導(dǎo)肌纖維發(fā)生壞死，導(dǎo)致肌肉萎縮，肌力下降，嚴(yán)重影響患兒的肢體功能和日常生活。據(jù)此推測DMD 患兒DGC 蛋白表達(dá)下降，且可能與Dystrophin 表達(dá)和病情嚴(yán)重程度相關(guān)。但目前關(guān)于這方面的研究鮮少，人們的認(rèn)識也尚淺，需加深研究，以期為DMD 的治療研究提供新思路。

本研究中DMD 組Dystrophin 和DGC 蛋白表達(dá)的IOD 值低于對照組，可知在DMD 患兒中Dystrophin和DGC 蛋白表達(dá)水平偏低，且均顯現(xiàn)出不同程度的缺乏。Dystrophin 是細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)絲狀肌動蛋白的連接骨架蛋白，與α-DG、β-DG 和α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG、Syntrophin 及包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶在內(nèi)的多種蛋白等共同組成DGC，可在肌纖維和肌膜反復(fù)機(jī)械收縮運動過程中發(fā)揮保護(hù)作用，若上述DGC 蛋白表達(dá)減弱，則對肌纖維和肌膜的保護(hù)作用減弱，在反復(fù)機(jī)械收縮運動中難以對機(jī)體發(fā)揮理想的積極作用，使得肌纖維和肌膜損傷，進(jìn)而引發(fā)進(jìn)行性加重的肌纖維肥大、肌無力、肌萎縮等表現(xiàn)[11-12]。此外，DGC 中部分蛋白的缺失可影響正常的信號傳導(dǎo)，肌纖維機(jī)械收縮功能被削弱，引發(fā)DMD，促使患兒肌無力和肌萎縮進(jìn)行性加重，影響其肢體功能。國內(nèi)外均有研究報道[13-15]，DMD 患兒Dystrophin 缺失，不僅增加肌纖維膜的通透性，使得大量鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而產(chǎn)生信號級聯(lián)放大效應(yīng)而誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，損傷肌肉組織，而且還損傷小血管的結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)肌纖維壞死。此外，DGC 缺乏可引起小血管阻塞，引發(fā)其周圍的肌纖維出現(xiàn)缺血缺氧性壞死。因此，DMD 患兒DGC 蛋白表達(dá)水平偏低且普遍缺乏可作為后期臨床治療方案研究的重要依據(jù)。

此外，本研究DMD 組不同病情分級患兒Dystrophin 和DGC 蛋白的表達(dá)、缺乏程度比較結(jié)果顯示：< 3 級最高、3～5 級次之、> 5 級最低，可知在DMD 患兒中Dystrophin 和DGC 與年齡并無明顯關(guān)聯(lián)，但與病情緊密相關(guān)。既往WILLIAMSON 等[16]報道也證實病情越嚴(yán)重，DMD 患兒DGC 蛋白表達(dá)越低，與本研究結(jié)果一致。分析其中原因為：在DMD 發(fā)病過程中肌纖維的變性、壞死及再生均在同步進(jìn)行，然而再生的肌纖維遠(yuǎn)不能滿足患者正常生活的需求，導(dǎo)致肌肉萎縮程度、肌無力等加重，因此DGC 嚴(yán)重缺乏可導(dǎo)致病情不斷加重[17]。此外，本研究中，DMD 患兒Dystrophin 染色與α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 表達(dá)均呈正相關(guān)。Dystrophin 表達(dá)越低，肌纖維變性和壞死的程度也越嚴(yán)重[18]；DGC 蛋白表達(dá)水平越低，缺乏程度越嚴(yán)重，肌纖維變性和壞死病情的程度也越嚴(yán)重。因此DMD 患兒Dystrophin 與DGC 密切相關(guān)。

綜上所述，DMD 患兒DGC 蛋白表達(dá)水平偏低，且其表達(dá)水平、缺乏程度與病情有關(guān)，α-DG、β-DG、α-SG、β-SG、γ-SG、δ-SG 及Syntrophin 蛋白表達(dá)水平越低，缺乏程度越嚴(yán)重，病情分級越高，與Dystrophin 染色結(jié)果呈正相關(guān)，提示在臨床治療期間應(yīng)注重上調(diào)DGC 的表達(dá)水平，減輕其缺乏程度，以期能夠有效控制患兒的病情。本研究存在的不足之處：DMD 患兒Dystrophin 與DGC 的調(diào)控機(jī)制尚未清楚，如何利用本研究結(jié)果探討新的治療方法也不明確，應(yīng)作為后期研究的重點方向。