外周血單核細(xì)胞在角膜上皮重建的體外研究

王萍 梁麗影 夏嬋 張弛

華廈眼科醫(yī)院集團(tuán)佛山華廈眼科醫(yī)院，佛山 528000

角膜是眼球的最外層，與外界環(huán)境接觸易受到各種傷害，視力的清晰度部分取決于角膜表面的光滑透明，這是由角膜層，特別是角膜上皮所維持的。角膜上皮來源于角膜緣基底上皮層的角膜緣干細(xì)胞，這些干細(xì)胞的功能障礙或喪失會損害角膜穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏疾病的發(fā)生，可致鄰近結(jié)膜上皮細(xì)胞侵入角膜表面引起角膜混濁、慢性炎癥、血管化、角膜瘢痕，甚至視力喪失。目前角膜緣干細(xì)胞缺乏疾病的治療策略包括健康對側(cè)眼角膜緣干細(xì)胞移植或異體角膜移植。自體角膜緣干細(xì)胞移植適用于單側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏患者，而對于雙側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏患者，有效治療需要免疫相關(guān)供體，且存在免疫排斥和供體短缺的問題。因此，需要相應(yīng)的替代治療，其中之一是確定治療角膜表面損傷的替代干細(xì)胞來源。最近的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞成功地應(yīng)用于各種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療中，是一類自我更新的前體細(xì)胞，具有抗炎和低免疫原性，容易從不同的組織類型［1-2］中獲得。據(jù)文獻(xiàn)報道，外周血單核細(xì)胞［3-4］具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［1］相似的生物學(xué)特征，易于獲取及體外進(jìn)行擴(kuò)增，且比其他干細(xì)胞［5］來源更安全，可作為角膜上皮重建的替代干細(xì)胞來源［6］。關(guān)于外周血單核細(xì)胞的使用及其從血液中分離報道較少，但近期其作為再生治療的干細(xì)胞來源引起了學(xué)者的關(guān)注。本研究旨在從小體積外周血中分離和鑒定單核細(xì)胞，收集單核遷移細(xì)胞，并研究單核遷移細(xì)胞是否具備替代角膜緣干細(xì)胞的潛能而用于角膜疾病治療。

材料與方法

1、材料

1.1、實驗動物 實驗時間為 2020 年 1 月至 2021 年1 月，實驗用5～8 月齡健康新西蘭大白兔30 只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限，來自暨南大學(xué)生理實驗室，所有大白兔均在無病原體的動物房喂養(yǎng)，均符合動物倫理委員會要求，同時獲得暨南大學(xué)動物倫理會批準(zhǔn)。

1.2、主要試劑和儀器 LG-DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）；CD14 單克隆抗體（Sigma）；兔抗小鼠細(xì)胞角蛋白單克隆抗體（cytokeratin，Sigma）；山羊抗小鼠二抗（LFSC-H，Sigma）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Transwell 共培養(yǎng)體 系 裝 置（Millipore）；32R 離 心 機(jī)（Hettich）；Eclipse TE2000-u 倒置相差顯微鏡（尼康公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）。

2、方法

2.1、外周血單核細(xì)胞分離與培養(yǎng) （1）取實驗用大白兔耳緣靜脈血10 ml移入自帶肝素的專用取血管，用10 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋1倍后移入無菌離心管內(nèi)。（2）按照制造商的說明，使用Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，美國）進(jìn)行密度梯度離心，獲得單核細(xì)胞。即取1 支容量為50 ml的離心管，將10 ml（體積質(zhì)量為1.077 g/ml）Ficoll-Paque 淋巴細(xì)胞分離液加入其內(nèi)，然后用吸管將剛獲取的20 ml 細(xì)胞混液沿管壁轉(zhuǎn)移到分離液層上，并置于離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，離心時間25 min（離心半徑90 mm）。（3）取出離心管，吸除表面稀釋的血漿，收集中央呈絮狀的細(xì)胞，將其移入另一支離心管中置于離心機(jī)內(nèi)離心5 min。（4）離心結(jié)束后吸除上清，收集離心細(xì)胞重懸于基本培養(yǎng)基，即含有10%胎牛血清和100 IU/ml青霉素-鏈霉素（Gibco Invitrogen，美國）的LG-DMEM/F12 中，將細(xì)胞濃度調(diào)整為10×104接種于T25 培養(yǎng)瓶中后置于培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼服于培養(yǎng)瓶壁后更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞間融合達(dá)80%以上消化離心后獲取細(xì)胞懸液用于本研究。

2.2、單核細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定

2.2.1、倒置相差顯微鏡觀察 將新鮮差速離心獲取的單核細(xì)胞懸液與在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后的貼壁單核細(xì)胞，分別置于相差顯微鏡下對比前后細(xì)胞形態(tài)是否有所改變，見圖1。

圖1 外周血單核細(xì)胞密度梯度離心分離方法示意圖

2.2.2、流式細(xì)胞術(shù)外周血單核細(xì)胞表面抗原鑒定 取第3 代單核細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用4%多聚甲醛取代培養(yǎng)基，將細(xì)胞固定在懸浮液中，用0.1% Triton X-100（Sigma）滲透細(xì)胞5 min，細(xì)胞與一抗（CD14）在室溫下孵育1 h，用PBS 沖洗后與二抗（抗小鼠FSC-H）孵育1 h。細(xì)胞重懸于PBS 中，流式細(xì)胞儀分選檢測陽性細(xì)胞，Cell-Quest 軟件分析計算單核細(xì)胞陽性率。

2.3、取帶有角膜緣和角膜上皮的組織塊 實驗用新西蘭大白兔耳緣靜脈處空氣處死，取其新鮮眼球放入含青/鏈霉素PBS 中浸泡30 min 后，再用含慶大霉素的PBS 反復(fù)沖洗干凈。將處理好的眼球放置于無菌超凈臺，大頭針固定眼球，用眼科穿刺刀在12點位角膜緣做一個3 mm淺層切口后分離前板層組織，分離角膜緣區(qū)域，剪下帶有角膜緣和角膜上皮的組織塊，用含抗生素的PBS 沖洗3 遍后，切成小塊放入Transwell共培養(yǎng)體系上室內(nèi)。

2.4、將單核遷移細(xì)胞與組織塊在Transwell 體系共培養(yǎng) 在Transwell共培養(yǎng)體系中將收集到的單核遷移細(xì)胞與帶有角膜緣和角膜上皮的組織塊共同培養(yǎng)7 d，上室放置新鮮組織塊，下室為單核遷移細(xì)胞。將實驗分為兩組，實驗組：與含有角膜緣和角膜上皮的組織塊在Transwell 體系內(nèi)共培養(yǎng)7 d；對照組：在Transwell 共培養(yǎng)體系中上室僅有基礎(chǔ)培養(yǎng)液，無組織塊，下室為單核遷移細(xì)胞，在此環(huán)境下共培養(yǎng)7 d。收集實驗組、對照組第1 天與第7 天細(xì)胞，各制備成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測其表面特異標(biāo)志物：細(xì)胞角蛋白，觀察共培養(yǎng)前與共培養(yǎng)后細(xì)胞表面特異抗原細(xì)胞角蛋白表達(dá)是否有所改變。

2.5、共培養(yǎng)單核細(xì)胞的觀察和鑒定

2.5.1、相差顯微鏡觀察 細(xì)胞生長情況倒置相差顯微鏡觀察Transwell 共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)7 d 后單核遷移細(xì)胞的形態(tài)數(shù)量改變。

2.5.2、誘導(dǎo)前流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性細(xì)胞 實驗組：收集共培養(yǎng)前的單核遷移細(xì)胞，用0.1% TritonX-100（Sigma）滲透細(xì)胞5 min，細(xì)胞與抗細(xì)胞角蛋白一抗在室溫下孵育1 h，用PBS 沖洗后與二抗（抗小鼠FSC-H）孵育1 h；對照組：采用二抗（抗小鼠FSC-H）孵育1 h，流式細(xì)胞儀分選單個陽性細(xì)胞，Cell-Quest軟件分析計算單核細(xì)胞陽性率。

2.5.3、誘導(dǎo)后流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性細(xì)胞 實驗組：將在Transwell 體系中已培養(yǎng)7 d的細(xì)胞消化離心制成細(xì)胞懸液，用0.1%TritonX-100（Sigma）滲透細(xì)胞5 min，細(xì)胞與抗細(xì)胞角蛋白一抗在室溫下孵育1 h，用PBS 沖洗后與二抗（抗小鼠FSC-H）孵育1 h；對照組：采用FSC-H 二抗單獨避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測分選陽性細(xì)胞，Cell-Quest 軟件統(tǒng)計分析陽性細(xì)胞率。

3、統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后細(xì)胞表面細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率指數(shù)的組間比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1、單核細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定

倒置相差顯微鏡觀察單核細(xì)胞形態(tài)見圖2，圖2A 為差數(shù)離心分離的單核細(xì)胞懸液，圖2B 為在適宜培養(yǎng)條件下單核細(xì)胞呈貼壁生長。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析單核細(xì)胞表面特異抗原CD14的陽性表達(dá)率為19.40%，見圖3。

圖2 倒置相差顯微鏡觀察單核細(xì)胞形態(tài)（×20）。A為單核細(xì)胞懸液，B為單核細(xì)胞貼壁生長

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞表面特異抗原CD14的陽性表達(dá)率

2、微環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)和其特異表面抗原陽性率改變情況

將在Transwell 共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7 d 的細(xì)胞放置于倒置相差顯微鏡觀察見圖4，細(xì)胞呈多數(shù)量多形態(tài)生長，細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)，包含多種細(xì)胞類型，呈成纖維樣和鵝卵石形細(xì)胞。實驗組誘導(dǎo)細(xì)胞表面特異抗原細(xì)胞角蛋白陽性率在誘導(dǎo)前為1.64%，在Transwell 體系中與新鮮角膜緣和角膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)7 d 后，細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞角蛋白陽性率為11.30%；對照組第1 天細(xì)胞表面特異抗原細(xì)胞角蛋白陽性率為1.42%，第7天細(xì)胞表面特異抗原細(xì)胞角蛋白陽性率為2.35%。見圖5、6。

圖4 倒置相差顯微鏡觀察在Transwell共培養(yǎng)體系中細(xì)胞呈多形態(tài)生長（×20）

圖5 實驗組細(xì)胞誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞角蛋白檢測（A 為誘導(dǎo)前細(xì)胞表面細(xì)胞角蛋白陽性率1.64%，B 為誘導(dǎo)后細(xì)胞表面細(xì)胞角蛋白陽性率11.30%）

3、微環(huán)境培養(yǎng)對單核遷移細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

將實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，誘導(dǎo)前，實驗組細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；對照組誘導(dǎo)前細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率與誘導(dǎo)7 d后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；實驗組誘導(dǎo)前細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率與誘導(dǎo)7 d 后比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這說明實驗組細(xì)胞表面特異標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白陽性率隨著共培養(yǎng)時間遞增呈現(xiàn)遞增趨勢；誘導(dǎo)7 d 后，實驗組細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這說明兩組細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率隨時間變化的趨勢有差異。見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)結(jié)果（%，）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)結(jié)果（%，）

注：實驗組為與含有角膜緣和角膜上皮的組織塊在Transwell體系內(nèi)共培養(yǎng)7 d；對照組為在Transwell 共培養(yǎng)體系中上室僅有基礎(chǔ)培養(yǎng)液，無組織塊，下室為單核遷移細(xì)胞，在此環(huán)境下共培養(yǎng)7 d

組別實驗組對照組t值P值n 15 15誘導(dǎo)前1.308±0.376 1.327±0.392 0.135 0.893誘導(dǎo)7 d后10.298±0.996 1.786±0.237 32.200<0.001 t值32.705 1.942 P值<0.001 0.063

討 論

角膜是眼球的最外層，易受到熱或化學(xué)損傷、感染等引起的各種傷害，角膜上皮是抵御外界損傷的第一道屏障，其更新和修復(fù)主要依賴于一類被稱為角膜緣干細(xì)胞（LSCs）的特殊干細(xì)胞的增殖來補充。LSCs存在于角膜緣基底部黑色素豐富的Vogt 柵欄區(qū)，可分化為短暫擴(kuò)充細(xì)胞及終末上皮細(xì)胞，是角膜上皮細(xì)胞增殖的主要來源，用于維持角膜上皮結(jié)構(gòu)和功能的完整［7］。任何損傷都會影響其正常的再生機(jī)制，導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏，角膜上皮持續(xù)缺損，血管化結(jié)膜上皮向角膜內(nèi)生長，角膜混濁，視力下降甚至失明。目前對于嚴(yán)重眼表疾病的主要治療方式為穿透性角膜移植或角膜緣組織移植，穿透性角膜移植術(shù)后因為需要長時間使用免疫抑制劑而引起局部或全身并發(fā)癥，也可能因為炎癥或新生血管產(chǎn)生排斥反應(yīng)致使移植失敗，而且存在供體來源有限等問題，限制了該項治療的臨床應(yīng)用。大多數(shù)嚴(yán)重的角膜緣損傷病例，如雙側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏，其角膜緣干細(xì)胞或角膜緣組織移植治療材料是異體來源的，這些方法存在缺乏健康供體組織和免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險，需要免疫抑制治療［8］。自體干細(xì)胞來源的替代細(xì)胞可以在眼表重建中發(fā)揮重要作用，因其避免了免疫排斥的風(fēng)險，且可從健康的個體［9］中獲得。

圖6 對照組細(xì)胞誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞角蛋白檢測（A為第1天細(xì)胞表面細(xì)胞角蛋白陽性率1.42%，B為第7天細(xì)胞表面細(xì)胞角蛋白陽性率2.35%）

干細(xì)胞在角膜疾病的應(yīng)用是近年來眼科領(lǐng)域研究熱點之一，包括上皮、間充質(zhì)、胚胎和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞［10-11］。間充質(zhì)干細(xì)胞，特別是脂肪和骨髓干細(xì)胞已經(jīng)顯示出其極大的分化潛能［12-13］，然而大多數(shù)情況下，其收集過程涉及侵入性手術(shù)，感染的高風(fēng)險以及由此帶來的疼痛感。由于這些缺點，外周血單核細(xì)胞在組織工程應(yīng)用中易于分離和獲取是優(yōu)于其他細(xì)胞來源的，具有表達(dá)角膜上皮標(biāo)志物潛能的單核細(xì)胞可能是替代非角膜緣干細(xì)胞的又一來源，作為體內(nèi)重要的成體干細(xì)胞，具有取材方便、易于體外培養(yǎng)、體外易保持生物活性等優(yōu)點［14-15］。外周血單核細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，且可分化為多種細(xì)胞，具有往中胚葉和神經(jīng)外胚葉分化的潛能，其分化潛能及方向很大程度受其所處干細(xì)胞微環(huán)境的影響和調(diào)控［16］。當(dāng)單核細(xì)胞生長微環(huán)境發(fā)生改變，細(xì)胞外的信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)，從而改變其分化方向。本實驗主要研究單核細(xì)胞在一定微環(huán)境誘導(dǎo)下是否具備往角膜上皮分化的潛能。

根據(jù)分化標(biāo)志物外周血單核細(xì)胞廣泛表現(xiàn)為CD14 陽性［17］，單核細(xì)胞表達(dá)了與間充質(zhì)干細(xì)胞相似的標(biāo)志物，可以被認(rèn)為是其亞類［18］。這些血液來源的細(xì)胞也被稱為循環(huán)間充質(zhì)干細(xì)胞，從骨髓和其他部位動員到血液。我們觀察到這些細(xì)胞大多是CD14陽性，本實驗中流式細(xì)胞儀測得單核細(xì)胞表面特異抗原CD14 表達(dá)陽性率是19.40%，單核遷移細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白的陽性率為1.64%。為了證明其表現(xiàn)出具有類似間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，并且易于分離，我們進(jìn)一步分析以確定其向角膜上皮分化的潛能。角膜上皮的分化是通過用角膜緣干細(xì)胞微環(huán)境培養(yǎng)來實現(xiàn)的。免疫細(xì)胞化學(xué)研究表明，細(xì)胞角蛋白是一種在脊椎動物中局限于角膜上皮細(xì)胞的終末分化標(biāo)志物，在角膜緣微環(huán)境培養(yǎng)誘導(dǎo)時細(xì)胞角蛋白表達(dá)上調(diào)，表明單核遷移細(xì)胞具有往角膜上皮譜系分化的潛力，其潛能可以考慮將其作為角膜再生治療中角膜緣干細(xì)胞的替代細(xì)胞來源。

本實驗將收集的單核遷移細(xì)胞置于Transwell共培養(yǎng)體系中，與帶有角膜緣和角膜上皮的組織塊共培養(yǎng)7 d，觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具備往角膜上皮細(xì)胞分化的潛能，流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后細(xì)胞表面特異性標(biāo)志蛋白細(xì)胞角蛋白表達(dá)陽性率變化情況。通過實驗結(jié)果可以觀察到誘導(dǎo)前流式細(xì)胞儀檢測單核遷移細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白的陽性率為1.64%，在Transwell 體系中與新鮮角膜緣和角膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)7 d 后，細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞角蛋白陽性率為11.30%。角膜上皮細(xì)胞來源于外胚層，細(xì)胞角蛋白為其特異標(biāo)志物，實驗組單核遷移細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率由1.64%改變?yōu)?1.30%，對照組單核遷移細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)率未見統(tǒng)計學(xué)意義。通過重復(fù)測量設(shè)計的方差分析顯示，單核遷移細(xì)胞在微環(huán)境誘導(dǎo)下細(xì)胞角蛋白陽性率有所變化，時間效應(yīng)也有統(tǒng)計學(xué)意義。

通過本實驗可以初步得出結(jié)論，單核遷移細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)條件下，可能具備往角膜上皮分化的潛能。使用單核遷移細(xì)胞作為自體干細(xì)胞替代細(xì)胞來源是治療雙側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏疾病的一種合乎邏輯和可實施的方法，同時表現(xiàn)出多譜系分化潛力，這使得該細(xì)胞來源在不久的將來成為重要的研究熱點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突