基于RON/PI3K通路研究上調(diào)miR-197對子宮肌瘤細胞侵襲和遷移的影響

唐娟 黃碧來 高麗玲

子宮肌瘤是一種由子宮平滑肌細胞增生誘發(fā)的良性腫瘤[1,2]，作為一種女性特有的疾病，子宮肌瘤發(fā)病率連年上升，患者大多臨床表現(xiàn)為腹部包塊、疼痛、子宮出血等，嚴重影響患者身體健康、生活質(zhì)量[3,4]。據(jù)相關流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，子宮肌瘤發(fā)病率與年齡具有一定相關性，絕經(jīng)期女性發(fā)病率高達50%左右[5]。臨床常用的治療子宮肌瘤的手段包括手術治療、藥物治療等。部分子宮肌瘤患者因心理、生育需求等因素，不愿接受手術治療，但是目前臨床尚無一種特效的治療子宮肌瘤的藥物，子宮肌瘤發(fā)病機制、新治療靶點探究成為許多專家的新的研究方向[6,7]。本文研究中設計實驗，靶向調(diào)控子宮肌瘤細胞微小RNA-197(miR-197)表達，探究調(diào)控miR-197對子宮肌瘤細胞侵襲、遷移的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細胞：子宮肌瘤細胞(中國醫(yī)學科學院)。主要試劑：小鼠抗兔miR-197、CD82抗體(BD公司)；大鼠抗兔Wnt3a、β-catenin抗體(Selleck公司)；兔抗小鼠MMP-2、MMP-9抗體(Hyclone公司)；小鼠抗大鼠Beclin-1抗體(Gibco公司)；大鼠抗小鼠LC3-Ⅱ抗體(Sigma公司)；小鼠抗大鼠CyclinD1抗體(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將子宮肌瘤細胞置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱(5% CO2)中，培養(yǎng)至細胞密度達90%，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞分組干預：miR-197引物：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，稀釋退火產(chǎn)物后相連接，使用大腸桿菌DH5α進行轉(zhuǎn)化，20℃環(huán)境下過夜，第2天選取單克隆菌落，接種后離心處理，室溫條件下?lián)u晃均勻、過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的細胞分為對照組、下調(diào)miR-197組、上調(diào)miR-197組，重懸處理后3組細胞分別使用4 μg 0.9%氯化鈉溶液、miR-197-siRNA、pcDNA3.1-miR-197干預，電擊后常溫靜置2 h，將各組細胞加至6孔、96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 指標檢測

1.3.1 RT-PCR檢測miR-197表達：將TRIzol試劑添加至各組細胞中靜置待溶解，并添加三氯甲烷600 μl攪拌，呈乳白色后離心處理提取總RNA，檢測完整性之后合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄處理，使用熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，2-△△Ct方法計算miR-197表達量數(shù)值。

1.3.2 細胞生物學行為檢測：MTT法檢測細胞增殖：取1×104細胞添加至96孔板，使用37℃培養(yǎng)箱(5% CO2)培養(yǎng)細胞72 h，在此過程中分別于24、48、72 h檢測細胞增殖抑制率。

1.3.2.1 TUNEL法檢測細胞凋亡：細胞添加20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)，30 min后去除蛋白、清洗，添加100 μl平衡緩沖液10 min后添加TdT酶反應液100 μl，遮光培養(yǎng)1 h后添加100 μl SSC溶液靜置，0.5 h后清洗、DAPI復染，避光培養(yǎng)10 min后清洗、封片觀察。

1.3.2.2 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲：濕化小室后添加200 μl細胞懸液，下室添加細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，置于培養(yǎng)箱中1 d，取出后PBS液清洗2次，置于4%多聚甲醛中染色0.5 h，顯微鏡下觀察。

1.3.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：細胞胰酶消化制備細胞懸液，接種于6孔板。使用10槍尖垂直于孔板底部畫直線，PBS緩沖液清洗3次。常溫培養(yǎng)24 h拍照計算劃痕。

1.3.3 Western blot法檢測CD82、細胞凋亡、自噬、侵襲相關蛋白表達:提取50 μg蛋白，煮沸至蛋白變性、SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子切開凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，Western封閉液室內(nèi)封閉待測、內(nèi)參蛋白90 min，1∶1 000添加待測蛋白抗體，1∶2 000添加內(nèi)參抗體孵育1 d，取出后使用Western洗滌液清洗5次，1∶5 000加入山羊抗兔，Western洗滌液洗滌后顯色、曝光、成像，檢測CD82、RON、PI3K、Beclin-1、LC3-Ⅱ、MMP-2、MMP-9、CyclinD1相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞miR-197、CD82表達比較 下調(diào)miR-197組細胞miR-197、CD82表達低于對照組，上調(diào)miR-197組細胞miR-197、CD82表達高于對照組、下調(diào)miR-197組，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組細胞miR-197、CD82表達比較

2.2 3組細胞增殖抑制、凋亡能力比較 下調(diào)miR-197組細胞各時間點增殖抑制率、凋亡率低于對照組(P<0.05)，上調(diào)miR-197組細胞各時間點增殖抑制率、凋亡率高于對照組、下調(diào)miR-197組(P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞增殖抑制、凋亡能力比較

2.3 3組細胞侵襲、遷移能力比較 下調(diào)miR-197組細胞侵襲、遷移細胞數(shù)高于對照組，上調(diào)miR-197組細胞侵襲、遷移細胞數(shù)低于對照組、下調(diào)miR-197組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組細胞侵襲、遷移能力比較 個,

2.4 3組細胞凋亡、自噬相關蛋白表達比較 下調(diào)miR-197組細胞RON相對表達量高于對照組，P13K、Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達量低于對照組；上調(diào)miR-197組細胞RON相對表達量低于對照組、下調(diào)miR-197組，P13K、Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達量高于對照組、下調(diào)miR-197組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 3組細胞凋亡、自噬相關蛋白表達比較

圖1 3組細胞凋亡、自噬相關蛋白表達WB圖

2.5 3組細胞侵襲相關蛋白表達比較 下調(diào)miR-197組細胞MMP-2、MMP-9、CyclinD1相對表達量高于對照組，上調(diào)miR-197組細胞MMP-2、MMP-9、CyclinD1相對表達量低于對照組、下調(diào)miR-197組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5，圖2。

圖2 3組細胞MMP-2、MMP-9、CyclinD1表達WB圖

表5 3組細胞侵襲相關蛋白表達比較

3 討論

臨床醫(yī)學尚未將子宮肌瘤發(fā)病機制研究透徹，許多專家學者通過分子生物學、基礎醫(yī)學等途徑探究子宮肌瘤發(fā)病機制，以期尋找新的治療靶點[8,9]。大量實驗研究表示，microRNA因其穩(wěn)定性、特異性的特點在細胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮重要作用[10,11]。miR-197為microRNA家族的主要組成成員，有研究表明，miR-197在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤組織及子宮肌瘤中表達異常[12]，但是國內(nèi)外關于調(diào)控miR-197表達對子宮肌瘤干預效果的研究還鮮有報道。本研究顯示，與子宮肌瘤細胞相比，上調(diào)miR-197表達的子宮肌瘤細胞CD82表達上調(diào)。CD82為TM4SF家族重要組成成員，其表達變化與細胞黏附、遷移、侵襲等能力具有密切聯(lián)系。本研究結(jié)果說明，miR-197、CD82在子宮肌瘤細胞中表達異常，上調(diào)miR-197表達能夠誘導子宮肌瘤細胞中CD82表達上調(diào)，從而影響子宮肌瘤細胞增殖、侵襲等生物學行為。

本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤細胞增殖抑制率、凋亡率較低，上調(diào)miR-197表達的子宮肌瘤細胞增殖抑制率、凋亡率較高，并且隨著時間推移呈現(xiàn)不斷上升趨勢。有學者在研究中表示，子宮肌瘤的發(fā)展演進過程伴隨著子宮肌瘤組織細胞增殖、凋亡能力的不斷變化[13]。有研究表明，抑制子宮肌瘤細胞增殖，促進子宮肌瘤細胞凋亡是抑制腫瘤細胞擴散、治療子宮肌瘤的關鍵[14,15]。本研究結(jié)果說明，上調(diào)miR-197表達能夠起到抑制子宮肌瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，抑制子宮肌瘤細胞的不斷擴散，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是上調(diào)miR-197表達使細胞凋亡通路蛋白表達受到調(diào)控。

本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-197表達的子宮肌瘤細胞中，RON表達下調(diào)，P13K表達上調(diào)，Beclin-1、LC3-Ⅱ表達上調(diào)。有研究表示，RON/PI3K通路蛋白表達變化與腫瘤組織細胞增殖、凋亡、侵襲等密切相關，參與膀胱癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是關于RON/PI3K通路蛋白表達與子宮肌瘤關系的研究還鮮有報道[16]。Beclin-1、LC3-Ⅱ是常用的評價細胞自噬情況的指標，二者表達變化與細胞自噬密切相關[17,18]。本研究結(jié)果說明，上調(diào)miR-197表達能夠調(diào)控RON/PI3K通路蛋白及自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達，從而起到促進子宮肌瘤細胞凋亡、自噬，抑制子宮肌瘤細胞增殖的作用，影響子宮肌瘤細胞的不斷發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-197表達的子宮肌瘤細胞侵襲、遷移細胞數(shù)較少，MMP-2、MMP-9、CyclinD1相對表達量較低。大量臨床研究表示，腫瘤組織的不斷發(fā)展演進與細胞侵襲、遷移能力變化密切相關，抑制細胞侵襲、遷移能力是抑制子宮肌瘤細胞不斷擴散的關鍵[19,20]。MMP-2、MMP-9、CyclinD1在腫瘤細胞分化、侵襲、遷移等行為中發(fā)揮重要的作用[21,22]。本研究結(jié)果說明，上調(diào)miR-197表達能夠抑制子宮肌瘤細胞侵襲、遷移能力，從而抑制子宮肌瘤細胞的不斷發(fā)展，其機制可能是上調(diào)miR-197表達能夠調(diào)控MMP-2、MMP-9、CyclinD1，從而起到抑制子宮肌瘤細胞侵襲、遷移的作用。

綜上所述，上調(diào)子宮肌瘤細胞miR-197表達，CD82表達也受到調(diào)控，細胞凋亡率上升，增殖、侵襲、遷移能力受到抑制，其機制可能是上調(diào)miR-197能夠調(diào)控RON/PI3K通路及細胞自噬、侵襲相關蛋白表達，從而影響子宮肌瘤細胞生物學行為，因此miR-197可作為子宮肌瘤新的治療靶點進行深入研究。