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      人經血干細胞移植對宮腔粘連組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E含量的影響

      2022-08-15 10:12:30李玲單鐵英劉聿謹宋玉杰李偉王芳楊慶賈慧
      河北醫(yī)藥 2022年15期
      關鍵詞:宮腔纖維化基質

      李玲 單鐵英 劉聿謹 宋玉杰 李偉 王芳 楊慶 賈慧

      宮腔粘連是子宮內膜組織由于多種致病因素造成的宮腔局部甚至全部出現粘連?;即瞬≌呓浟肯∩佟⒔浧诟雇?、閉經、易流產以及不孕等癥狀[1,2]。嚴重影響有生育要求的女性患者的生殖能力。子宮內膜組織呈現纖維化改變?yōu)閷m腔粘連的主要病理學特點,也是眾多醫(yī)學界的研究者們研究和治療此病的關鍵入手點。已有實驗研究顯示,體外培養(yǎng)的人經血干細胞(human menstrual stem cells,MenSCs)在適當條件和細胞因子的誘導下可以向子宮內膜上皮細胞轉化[3,4]。但筆者查閱文獻后發(fā)現將其接種到宮腔粘連的組織表面后,能否起到修復作用尚不清楚。因此,我們將MenSCs均勻接種到發(fā)生粘連的宮腔內表面,觀察子宮內膜組織的結構改變及內膜組織中的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及鈣粘蛋白E含量的變化,探索MenSCs接種改善宮腔黏連的機制,為宮腔粘連的治療提供一種新策略。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 獲取經血:收納來自邯鄲市中心醫(yī)院體檢中心檢查的健康女性,平均年齡(34.1±1.9)歲,詳細告知情況后,自愿簽署知情同意書,均采用無菌方法處理后的杯子收集經血標本,迅速送到在實驗室的超凈臺中,無菌分離出MenSCs。

      1.1.2 實驗動物:SD大鼠購自河北工程大學醫(yī)學部動物研究所,許可證號:SCXK(冀)2020-6-316,合格證編號:614273,雌性,月齡(12.0±1.7)月,體重(327.3±11.7)g。

      1.1.3 主要試劑:蘇木素-伊紅染液、Masson 染液、α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E抗體和免疫組化試劑盒均購自R&D System。

      1.2 方法

      1.2.1 MenSCs的純化、鑒定及培養(yǎng):向收集的經血中加入等容積的緩沖液,放入12 cm直徑離心機中,1 200 r/min持續(xù)轉動10 min,吸出離心管上端的懸液,滴入單核細胞分離液,再離心0.5 h,在離心管中出現一薄層的白膜,仔細用吸管吸出薄層含有細胞的白膜,加入緩沖液清洗細胞后,留取少許細胞用于形態(tài)觀察、流式細胞術用于檢測細胞種類鑒定。其余細胞放入中等培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中孵育。

      1.2.2 大鼠造模及分組:采用麻醉液麻醉處于非動情期的大鼠18只,沿大鼠的腹中線剪開腹部皮膚,充分顯露出子宮的左右側支,搔刮子宮右側支的宮壁,搔刮時當手感到有粗糙感時即可停止,縫合腹部后放回籠中飼養(yǎng)1周。實驗分為對照組、模型組和MenSCs組,每組6只。對照組:正常健康的大鼠;模型組:搔刮子宮右側支宮壁的大鼠;MenSCs組:模型組大鼠飼養(yǎng)1周后向粘連宮腔接種濃度為2×106個/ml的MenSCs 200 μl。3組分籠飼養(yǎng)28 d后,均取子宮的右側支放入固定液中固定,以備進行后續(xù)實驗。

      1.2.3 子宮內膜組織切片的制作、染色及形態(tài)結構的觀察:固定好的3組小塊子宮內膜組織,從70%的乙醇開始到100%的乙醇結束,依次浸沒于百分含量逐漸升高的乙醇中脫去組織中的水分,然后浸沒于融化的液態(tài)石蠟中,冷卻變硬固化后,固定在切片機里切割為標準厚度的組織薄片,從100%的乙醇開始到70%的乙醇結束,依次浸沒于百分含量逐漸降低的乙醇中脫去組織中的石蠟,最后浸沒于水中。遵循試劑的操作說明對組織切片行蘇木素-伊紅染色和Masson 染色。觀察子宮內膜組織的形態(tài)結構的變化,并統(tǒng)計比較3組子宮內膜組織中的腺體個數以及纖維化面積。

      1.2.4 蛋白印跡技術分析組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E的相對值:將3組相同質量的塊狀子宮內膜組織分別加入適量的緩沖液放入勻漿機中,快速打碎并研磨為均勻的漿液,在漿液中加入適當配比的預冷的裂解液靜置20 min,離心機離心后得到的上清液即為組織里的總量蛋白,取少許的蛋白樣品,確定其中的蛋白含量。將蛋白熱變性后,使用移液器定量吸取40 μg注入提前制備好的濃縮凝膠上端得小孔底端,將膠置于含有電泳液的電泳槽中,設置恒定電壓和恒定電流后啟動電泳,持續(xù)2 h。截取經電泳分離的膠塊里的目的蛋白條帶,與薄膜貼緊后放入轉膜儀中,將目的蛋白條帶轉到薄膜里,常溫下逐次投到脫脂奶粉液、第一抗體溶液(α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E)、洗膜液、第二抗體溶液、洗膜液。進入暗室中將蛋白條帶顯色和顯影于X線片中。掃描X線片中的蛋白條帶,以β-actin為內參分析并統(tǒng)計比較各組X線片里的平均灰度相對值。

      2 結果

      2.1 MenSCs的形態(tài)結構觀察及類型鑒定結果 剛分離出來并且經過純化的MenSCs呈單個、散在、體積較小的圓形,經1周常規(guī)培養(yǎng)后,貼培養(yǎng)瓶的瓶底壁生長,體積增大呈長梭狀。采用流式細胞技術分析發(fā)現,細胞表面的分子類型以及它們各自的表達率分別為OCT-4(96.12±0.13)%、CD-45(1.32±0.11)%、Strol-1(95.45±0.19)%,這些分子類型和它們的表達率充分證明獲取的細胞為MenSCs。見圖1。

      2.2 3組子宮內膜組織的結構比較 3組子宮內膜組織經蘇木素-伊紅染色后發(fā)現,對照組內膜組織從外到內依次為上皮層和固有層,固有層中有腺體。模型組內膜組織無上皮層,只顯示固有層并且其厚度增加,固有層中的基細胞數量較少而基質含量增多,其中沒有發(fā)現腺管的結構。MenSCs組的內膜組織顯示出新生長出來的上皮層,固有層基細胞數量較多而基質含量減少,其中可見數個腺管結構。見圖2,表1。

      圖2 3組內膜組織的形態(tài)結構(蘇木素-伊紅染色×200);A 正常組;B 模型組;C MenSCs組

      2.3 3組內膜組織纖維化程度的比較 3組子宮內膜組織經過Masson 染色后顯示,組織中的藍色面積表示為纖維化面積,3組內膜組織呈現出不同程度的藍色面積。對照組內膜組織固有層中藍色面積含量較少,纖維化面積占總組織面積的比例較少。模型組固有層藍色面積所占比例較對照組顯著增多(P<0.05)。MenSCs組藍色面積所占比例較模型組減少(P<0.05)。見圖3,表1。

      圖3 3組內膜組織的纖維化面積(Masson 染色×200);A 正常組;B 模型組;C MenSCs組

      表1 3組腺體數量、纖維化面積比例比較

      2.4 3組內膜組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E含量的比較 模型組內膜組織中的α-SMA和TGF-β1含量較對照組增加,而鈣粘蛋白E含量降低 (P<0.05);MenSCs組內膜組織中的α-SMA和TGF-β1含量較模型組降低,而鈣粘蛋白E含量較模型組升高 (P<0.05)。見表2,圖4。

      圖4 免疫印跡顯示各組內膜組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E的蛋白條帶灰度

      表2 3組內膜組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E含量比較

      3 討論

      正常的子宮內膜組織有表面的上皮組織和其下面的固有層組成,固有層中含有豐富的毛細血管,因此,宮腔鏡下顯示為粉紅色。而宮腔粘連的子宮內膜組織正常的上皮組織消失,其下面的固有層結締組織增厚并且發(fā)生纖維化的病理改變?yōu)閷m腔粘連的病理特點,宮腔鏡下可以顯示,黏連的子宮腔的體積窄小,纖維化的病變部位內膜組織呈白色的斑狀或呈條索狀,質地較硬。導致宮腔發(fā)生黏連的致病因素較多,宮腔粘連的患者經常以多次流產或不易懷孕而來醫(yī)院就診,黏連程度嚴重的患者經常規(guī)治療后比較容易復發(fā)。因此,探索宮腔粘連的發(fā)病機制,發(fā)現新的有效的治療此病的作用靶點尤為重要。

      研究發(fā)現TGF-β為導致機體多種器官組織發(fā)生纖維化改變的起關鍵作用的生物學細胞因子,其中TGF-β1為生物學活性最強的成員[5,6]。如果組織中TGF-β1含量異常增高,那么其發(fā)生纖維化的進程就會越快。其具體作用機制為:(1)它可以增強結締組織中的成纖維細胞的活性并使其分泌大量的基質成分,刺激抑制基質成分降解的生物學因子合成增加,而基質成分降解的酶蛋白合成降低,從而導致過量的基質成分沉積在細胞間隙中,最終導致組織發(fā)生纖維化病變[7,8];如果減弱或消除組織中TGF-β1的活性能明顯改善多種器官組織的纖維化病變進程[9]。(2)TGF-β1在組織中的含量異常增高,將會阻止上皮細胞的正常生長和生物學活性,并能使之向間質細胞的表型和特性轉分化[10-13],上皮細胞表面的起粘附作用的分子-鈣粘蛋白E表達缺失,而表達間質細胞特有的標志性分子α-SMA,并能合成和分泌大量的基質成分到細胞間隙中[14,15]。已有文獻證實宮腔粘連的內膜組織中TGF-β1的含量高于正常的子宮內膜組織,這說明TGF-β1參與了宮腔粘連的發(fā)生和發(fā)展過程[16,17]。

      我們的實驗研究結果表明:宮腔粘連的內膜組織中無上皮組織覆蓋,只顯示固有層并且其厚度增加,固有層中的基細胞數量較少而基質含量增多,其中沒有發(fā)現腺管的結構。組織中所含的纖維化面積增多,α-SMA和TGF-β1的含量升高、而鈣粘蛋白E的含量降低。

      近年來的實驗研究表明,在體外適當細胞因子的培養(yǎng)下,有許多種類從機體來源的干細胞,例如從胎兒羊膜、成人的骨髓及脂肪組織獲取的干細胞,經過適當的誘導均能分化為子宮內膜細胞;并且將其接種到粘連的內膜組織表面后,均能改善宮腔黏連的程度并能起到修復的作用[18-20]。但它們的獲取途徑經常會對機體造成不同程度的創(chuàng)傷,且存在較多的風險和倫理學爭議。MenSCs存在于子宮內膜組織里,可隨月經產生的血液排出體外,其有干細胞的特性,并且具有免疫排斥反應弱、獲取途徑容易、無風險和倫理爭議等優(yōu)點[21,22]。

      我們的實驗研究結果表明:將MenSCs接種到粘連組織表面后,內膜組織會顯示出新生長出來的上皮層,固有層基細胞數量較多而基質含量減少,其中可見數個腺管結構,組織中的纖維化面積減少,α-SMA和TGF-β1降低,鈣粘蛋白E升高。均說明MenSCs接種到宮腔黏連組織表面后,能分化為子宮內膜上皮細胞,修復內膜組織的纖維化損傷和改善宮腔黏連,為探索宮腔粘連的治療方案提供了新的思考方向。

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