牛冠狀病毒流行病學(xué)和疫苗研究進(jìn)展

苗 艷，朱慶賀，陳 亮，蘭世捷，馮萬(wàn)宇，李 丹，張 蕾，沈思思，田秋豐，金振華，史同瑞*，李 白

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.呼瑪縣畜牧總站，黑龍江大興安嶺 165000)

牛冠狀病毒(Bovine coronaviruses, BCoVs)是一種嚴(yán)重危害牛健康的病原，廣泛存在于世界各地的牛群中，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。BCoVs可引起犢牛腹瀉(Calf diarrhea, CD)和成牛冬季痢疾(Winter dysentery, WD)，以及幼牛上下呼吸道感染[2-3]，從腹瀉犢牛的糞便樣本和呼吸道樣本中常分離到BCoVs[4-6]。BCoVs廣泛分布于世界多個(gè)國(guó)家，在我國(guó)青海、新疆、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、廣西、黑龍江等省份均檢測(cè)出該病毒[7-9]。目前尚無(wú)治療BCoVs感染的特效藥物，疫苗接種和程序化防控是預(yù)防BCoVs感染的主要措施。掌握BCoVs的流行病學(xué)動(dòng)態(tài)和疫苗研究狀態(tài)可對(duì)診斷BCoVs和新型疫苗的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 病原學(xué)

1.1 BCoVs結(jié)構(gòu)和分類(lèi) BCoVs屬巢病毒目、冠狀病毒科、正冠狀病毒亞科、β冠狀病毒屬，與豬戊型肝炎病毒(HEV)、犬呼吸道冠狀病毒(CoV)及人冠狀病毒CoV-OC43 及HKU1同屬于β冠狀病毒屬2a亞群成員[10]，是一種有囊膜的單股正鏈RNA(ssRNA)病毒，直徑在65～210 nm之間，由一層短的血凝素和一層長(zhǎng)的延伸至表面的刺突蛋白包裹?；蚪M大小在27～32 kb之間，編碼5種主要結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(N蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和血凝素酯酶(HE)糖蛋白[11]。其中，核衣殼蛋白(N蛋白)在毒株中最為保守，常被用于進(jìn)行病毒RNA檢測(cè)[12]。S蛋白所包含的S1亞基上有主要的中和表位，S2亞基能夠介導(dǎo)病毒融合蛋白，負(fù)責(zé)吸附靶細(xì)胞受體和進(jìn)行膜融合。E蛋白參與病毒的裝配。M蛋白包含能夠被B細(xì)胞識(shí)別的表位。HE是一種能夠破壞受體的酶(酯酶)，能進(jìn)行反向血凝。HE蛋白和S蛋白都是重要的病毒蛋白，與病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和對(duì)雞、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠紅細(xì)胞的凝集都相關(guān)，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，從而阻止病毒的吸附和感染，對(duì)抗病毒免疫和疫苗的研制至關(guān)重要[1]。

1.2 BCoVs致病機(jī)制 動(dòng)物通過(guò)糞口途徑或氣溶膠的吸入感染冠狀病毒[1,13]。BCoVs通過(guò)S蛋白的S1蛋白部分結(jié)合到細(xì)胞膜受體(N-乙?；?9-O-乙酰神經(jīng)氨酸)從而侵入細(xì)胞。S蛋白的S2蛋白部分調(diào)節(jié)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合[14]。病毒的最初復(fù)制發(fā)生在呼吸道(鼻腔、氣管和肺)還是胃腸道(腸上皮細(xì)胞)目前尚且是一個(gè)有爭(zhēng)論的問(wèn)題。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，最初的復(fù)制發(fā)生在呼吸道，大量的病毒被粘液保護(hù)然后被吞入從而去感染腸道[1,13];另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，BCoVs最開(kāi)始感染的是胃腸道，然后通過(guò)病毒血癥到達(dá)呼吸道[15]。BCoVs在糞便和鼻分泌液中都有排放，病毒排放持續(xù)期較長(zhǎng)，Kanno等2018年報(bào)道，他們通過(guò)巢式PCR對(duì)鼻腔和糞便中的病毒進(jìn)行檢測(cè)，分別最長(zhǎng)在感染后的932 d和1058 d都檢測(cè)到了病毒[16]。BCoVs傳播的最常規(guī)路線是從母畜到犢?；蛟跔倥ｉg進(jìn)行傳播。畜群之間的傳播，主要通過(guò)新動(dòng)物的購(gòu)進(jìn)或通過(guò)被病毒污染的物品。犬已被當(dāng)做一種牛冠狀病毒的攜帶者[15]。BCoVs對(duì)整個(gè)胃腸道都有影響，從十二指腸開(kāi)始直至大腸，導(dǎo)致腸絨毛萎縮和其他黏膜損傷。在呼吸道，其引起間質(zhì)性肺炎、鼻甲、氣管和肺上皮損傷[13,17-18]。

2 流行病學(xué)

BCoVs是引起3周齡以內(nèi)奶牛和肉牛腹瀉的主要病原之一，通過(guò)破壞腸絨毛，導(dǎo)致嚴(yán)重的、經(jīng)常性腸道出血和腹瀉。BCoVs感染引起的WD會(huì)造成奶牛產(chǎn)奶量的大幅度減少，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。WD主要發(fā)生在寒冷地區(qū)，但在一些熱帶國(guó)家也有報(bào)道，如泰國(guó)、巴西等[3,19]。BCoVs不僅存在于腸道中，還存在于肺臟中。根據(jù)臨床癥狀將BCoVs分為兩個(gè)群：從腹瀉的小牛和成牛中分離到的BCoVs被稱為牛腸道冠狀病毒(Bovine enteric coronaviruses，BECoVs)，從有呼吸道臨床癥狀的動(dòng)物中分離到的冠狀病毒被稱為牛呼吸道冠狀病毒(Bovine respiratory coronaviruses，BRCoVs)。BECoVs再細(xì)分為引起犢牛腹瀉(CD)的BECoVs(BECoVs-CD)和引起成牛冬季痢疾(WD)的BECoVs(BECoVs-WD)[15]。牛冠狀病毒病的臨床表現(xiàn)不只與病毒本身的致病性相關(guān)，而且與宿主和環(huán)境因素相關(guān)，例如：動(dòng)物自身的免疫狀態(tài)、環(huán)境溫度以及與其他病原的二次混合感染。

2.1 BECoVs流行病學(xué) Mebus于1972年在內(nèi)布拉斯加州大學(xué)偶然發(fā)現(xiàn)BCoVs后[20]，病毒很快被分離和鑒定[21]，隨后被認(rèn)為是一種可引起奶牛和肉牛腹瀉的常見(jiàn)病原，主要通過(guò)患病牛的糞便進(jìn)行傳播。最易感年齡為出生后30 d內(nèi)[15]，潛伏期為1～7 d，臨床癥狀持續(xù)3～6 d[21-23]。在自然發(fā)生的牛腹瀉疾病疫情中，BECoVs感染引起的腹瀉在15%～70%之間，最早可以在剖宮產(chǎn)犢牛出生后24 h時(shí)，最晚至犢牛5月齡時(shí)檢測(cè)到該病毒。被感染后的犢牛開(kāi)始排放大量BCoVs，可持續(xù)排放兩周，而恢復(fù)期的犢牛排毒量通常都較低[22]。在腹瀉犢牛和健康犢牛糞便中均可檢出BCoVs，但腹瀉犢牛檢測(cè)陽(yáng)性率(8%～69%)要高于健康犢牛(0%～24%)[22]。盡管有血清BCoVs特異性抗體和腸道BCoVs特異性抗體存在，但仍在超過(guò)70%以上的健康牛樣品中檢測(cè)到低水平的BCoVs呈間歇性排放[22]。由于BCoVs在外界溫度較低和紫外光強(qiáng)度較弱時(shí)更易存活，所以在冬季的幾個(gè)月時(shí)間里，BCoVs排放率增加了50%～60%，這就可能導(dǎo)致成牛發(fā)生冬季痢疾[24-25]。在分娩時(shí)，BCoVs的排毒量也會(huì)增加65%，產(chǎn)后兩周由于母牛免疫和激素紊亂會(huì)增加71%，因此，由于產(chǎn)后接觸污染的會(huì)陰、乳頭和產(chǎn)房，BCoVs陽(yáng)性母牛所產(chǎn)犢牛的腹瀉概率更高[24]。

2.2 BRCoVs流行病學(xué) Thomas等于1982年首次鑒定了BCoVs為一種與犢牛肺炎相關(guān)的病毒[26]。隨后，很多研究人員也證明，盡管在個(gè)體分離株之間血清型和抗原上有差異，但BECoVs和BRCoVs都是相同準(zhǔn)種的成員[22]。BCoVs在所有年齡段的有呼吸疾病的牛上均被分離和檢測(cè)到[1,27-28]。臨床癥狀包括流鼻涕、呼吸困難、咳嗽、發(fā)燒和呼吸窘迫等[28]。Hasoksuz等的研究證明，BRCoVs的鼻腔和糞便排毒率分別為84%和96%[29]。Thomas等的研究證明，運(yùn)達(dá)飼養(yǎng)場(chǎng)前三天的受試牛鼻腔排毒量始終高于糞便排毒量[30]。Gulliksen等對(duì)挪威的135個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行了BCoVs的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，BCoVs血清抗體陽(yáng)性犢牛比陰性犢?；己粑膊〉奈ｋU(xiǎn)性更高[31]。Lathrop等的研究證明，通過(guò)鼻腔排放BRCoVs的飼養(yǎng)場(chǎng)犢?？赡芨谆己粑到y(tǒng)疾病，且比不排放BRCoVs的動(dòng)物肺部病變更嚴(yán)重[32]。鼻腔排放BRCoVs的犢牛比不排放的犢牛更易有呼吸道疾病[29-30]。

盡管已經(jīng)通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查和常規(guī)診斷得到了大量的佐證，但有關(guān)BCoVs誘導(dǎo)的呼吸道疾病和相關(guān)病理變化的證據(jù)仍不足。Ellis提出，僅通過(guò)在患病動(dòng)物呼吸道樣品中檢測(cè)出BCoVs來(lái)判定BCoVs為誘導(dǎo)呼吸道疾病的病原是不足的，需進(jìn)一步調(diào)查研究來(lái)證明病毒載體和臨床癥狀之間的這種因果關(guān)系[33]。BCoVs是否可以直接作為一種呼吸道病原仍存爭(zhēng)議。

2.3 我國(guó)BCoVs流行情況 BCoVs在我國(guó)多個(gè)省份和地區(qū)廣泛流行。彭昊等對(duì)廣西地區(qū)冠狀病毒感染引起的牛腹瀉病流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示BCoVs陽(yáng)性率為17%[34]。崔鑫等對(duì)新疆12個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)的325份犢牛糞便樣品進(jìn)行BCoVs檢測(cè)，結(jié)果顯示，BCoVs陽(yáng)性率為9.54%[35]。Abi Keha等在我國(guó)6個(gè)省14個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共采集腹瀉犢牛糞便190份，結(jié)果檢測(cè)到36份BCoVs陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為18.95%[36]。何琪富等對(duì)青藏高原29個(gè)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)的336份腹瀉樣本進(jìn)行BCoVs檢測(cè)，結(jié)果有232份樣品陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)69.05%[37]。楊海峰等對(duì)我國(guó)奶牛養(yǎng)殖量較大的14個(gè)省市的29個(gè)規(guī)?；翀?chǎng)未斷奶的犢牛進(jìn)行呼吸道疾病綜合征評(píng)估，結(jié)果顯示，在176份樣品中38份BCoVs陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為21.59%，其中采自黑龍江的病料中冠狀病毒檢出率達(dá)70%，新疆次之，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性病例與呼吸道疾病綜合征臨床癥狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，病畜的發(fā)熱、鼻腔分泌物性狀改變與BCoVs密切相關(guān)[7]。張坤等對(duì)新疆北疆地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)犢牛腹瀉冠狀病毒病原進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示在檢測(cè)的125份病料中BCoVs RT-PCR擴(kuò)增陽(yáng)性樣品檢測(cè)出65份，對(duì)N基因和S1的基因序列分析結(jié)果表明，新疆北疆地區(qū)的BCoVs與參考毒株的同源性較高，且親緣關(guān)系具有地域性[38]。我國(guó)關(guān)于BCoVs的研究起步較晚，有關(guān)其流行病學(xué)調(diào)查的研究較少，但近年來(lái)BCoVs的流行又較為嚴(yán)重，因此需要對(duì)該病毒高度重視。

3 疫 苗

3.1 BECoVs疫苗 新生犢牛較易感染BCoVs，通常在產(chǎn)犢前給母牛進(jìn)行疫苗接種，從而使母牛產(chǎn)生抗體，犢牛通過(guò)母牛初乳中的抗體獲得被動(dòng)免疫[39]。此外，犢?？梢栽?日齡或稍微大一些日齡接種一種減毒活鼻內(nèi)疫苗，可誘導(dǎo)一種能夠迅速產(chǎn)生干擾素的先天免疫應(yīng)答，這會(huì)使其快速產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。流行病學(xué)研究表明，中和抗體和紅細(xì)胞凝集抗體水平與所產(chǎn)生的保護(hù)作用相關(guān)[1]。鼻內(nèi)疫苗通常在3～4日齡通過(guò)注射器一次性接種，也可當(dāng)犢牛大些進(jìn)入飼育場(chǎng)時(shí)接種鼻內(nèi)疫苗。滅活疫苗也在懷孕牛上被使用。目前市面上有兩類(lèi)可用于預(yù)防BCoVs引起的新生犢牛腸道疾病的疫苗。一類(lèi)是滅活疫苗，包括美國(guó)輝瑞動(dòng)物保健公司的Scour Guard 3(K)、美國(guó)先靈葆雅動(dòng)物保健的Guardian、瑞氏諾華動(dòng)物保健的Scour-Bos，這三種疫苗通過(guò)對(duì)懷孕晚期的母牛進(jìn)行接種以使所產(chǎn)犢牛獲得被動(dòng)免疫。目前認(rèn)為，通過(guò)初乳被動(dòng)免疫是犢牛接種BCoVs的可靠模式。只有在出生后24 h內(nèi)獲得免疫孕牛產(chǎn)生的高水平的初乳IgG1才能保護(hù)新生犢牛免受BCoVs感染，而24 h后免疫的犢?？赡艿貌坏奖Ｗo(hù)。另一類(lèi)是改良的活疫苗，包括美國(guó)默克公司的Bovilis和Guardian、美國(guó)輝瑞動(dòng)物保健公司的Calf-Guard、ScourGuard 4KC和 BoviShield Gold 5、日本京都KyotoBiken實(shí)驗(yàn)室的 CattleWin BC，這三種疫苗通過(guò)口服給新生犢牛以提供主動(dòng)免疫。然而，在奧地利進(jìn)行的一項(xiàng)實(shí)地研究中，這種免疫接種的效力受到質(zhì)疑[15]。除了注射時(shí)間和疫苗免疫效果，還需考慮的是接種疫苗后對(duì)所選擇接種部位的影響。在早期的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，用減毒的呼吸道毒株疫苗給牛進(jìn)行肌肉注射是安全的[40]。但在另一項(xiàng)研究中，用滅活的BCoVs和細(xì)菌成分的疫苗給牛進(jìn)行肌肉注射接種，結(jié)果顯示大約有50%的牛跛行并發(fā)展為肌炎[41]。

3.2 BRCoVs疫苗 現(xiàn)代疫苗接種計(jì)劃中使用多價(jià)滅活疫苗、改良的活病毒疫苗和減毒細(xì)菌抗原來(lái)降低牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的發(fā)病率和流行率，但沒(méi)有一種用于預(yù)防BRCoVs的商品化的疫苗，且對(duì)BRCoVs的免疫保護(hù)研究也較少。Plummer等使用改良的冠狀病毒和輪狀病毒活疫苗鼻內(nèi)接種犢牛，顯著降低了到達(dá)飼養(yǎng)場(chǎng)時(shí)有較低滴度BCoVs血清抗體的犢牛隨后的呼吸道疾病風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)論是單獨(dú)使用還是與牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1，BHV-1)聯(lián)合使用，在降低飼養(yǎng)場(chǎng)牛BRDC發(fā)病率和后續(xù)治療方面可能具有協(xié)同效應(yīng)或產(chǎn)生其他效應(yīng)[42]。BCoVs抗體滴度可能與對(duì)呼吸道感染的保護(hù)作用相關(guān)，并可能減少病毒在鼻腔分泌物中的排放[43]。Hasoksuz等的研究結(jié)果顯示，BCoVs抗體滴度大于1600的牛的糞便或鼻腔不會(huì)排放BCoVs[29]。Thomas等建議，飼養(yǎng)場(chǎng)犢牛至少應(yīng)在運(yùn)輸前3周接種BCoVs疫苗，以誘導(dǎo)產(chǎn)生血清IgG滴度達(dá)1860以上，從而對(duì)BCoVs感染及其與BRDC有關(guān)的其他病原體混合感染產(chǎn)生保護(hù)作用[30]。

未來(lái)的疫苗研究方向是開(kāi)發(fā)出一種能夠預(yù)防不同BCoVs野毒株的疫苗，以預(yù)防不同臨床癥狀的BCoVs感染。研究一種包含CD、WD和呼吸道分離株的多毒株混合疫苗可能是開(kāi)發(fā)廣譜BCoVs疫苗的理想策略，這種疫苗可能有效預(yù)防各種BCoVs感染。

4 小結(jié)與展望

不同的冠狀病毒可以感染多種家畜，包括狗、貓、牛、豬和家禽等，而其中多數(shù)都能通過(guò)常規(guī)疫苗接種進(jìn)行控制。BCoVs疫苗已被廣泛用于預(yù)防BCoVs感染，它能夠保護(hù)犢牛免于由BCoVs感染引起的腸道和呼吸道疾病。但目前的疫苗也存在一些缺點(diǎn)，如保護(hù)性免疫的持續(xù)期相對(duì)較短，缺少有效的滅活苗等，還需要進(jìn)一步研究以預(yù)防該病和限制其傳播。目前有關(guān)該病毒的遺傳信息仍然有限。BECoVs和BRCoVs尚未明確區(qū)分，它們確實(shí)在很大程度上發(fā)生交叉反應(yīng)。BCoVs和BRDC之間的因果關(guān)系尚未明確，這是在疾病預(yù)防或預(yù)處理計(jì)劃中必須考慮的問(wèn)題。

未來(lái)的研究領(lǐng)域包括了解BECoVs和BRCoVs的發(fā)病機(jī)制，BCoVs和BRDC的因果關(guān)系，BCoVs與宿主和環(huán)境因素之間的相互作用關(guān)系，BCoVs的種間傳播宿主范圍和調(diào)控機(jī)制等。