Bcl-6對濾泡輔助性T細胞的調(diào)控作用及機制進展

何 嵐， 王 猛， 姜 浩

(1.湖南大學(xué)生命醫(yī)學(xué)交叉研究院， 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)湖南省重點實驗室， 長沙 410012；2.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所， 上海 200031； 3.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 長沙 410006)

Bcl-6屬于Bcl(B cell lymphoma， B細胞淋巴瘤)家族蛋白，作為人類非霍奇金淋巴瘤中染色體易位最頻繁基因之一首次被克隆，對細胞活化、分化、細胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等多個生命過程起調(diào)控作用.近年來的研究發(fā)現(xiàn)Bcl-6是Tfh細胞(follicular helper T cell， 濾泡輔助性T細胞)的亞群決定因子，對Tfh細胞分化和功能調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用[1].

1 Bcl-6概述

Bcl-6蛋白由706個氨基酸組成，屬于BTB-POZ(bric-a-brac， tramtrack， broad complex/poxvirus zinc finger)轉(zhuǎn)錄因子家族，是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的序列特異性轉(zhuǎn)錄共抑制因子.Bcl-6 N端為BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，可進行蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用；中間區(qū)域含3個PEST結(jié)構(gòu)域，參與蛋白的穩(wěn)定性和活性調(diào)節(jié)；C端含6個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，是特異性DNA結(jié)合位點.Bcl-6可通過BTB/POZ結(jié)構(gòu)域招募其他轉(zhuǎn)錄共抑制因子，或與其他鋅指結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，然后結(jié)合特異性DNA序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用.Bcl-6在生發(fā)中心B細胞分化和發(fā)育過程中十分重要，是生發(fā)中心B細胞的亞群決定因子，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其對Tfh細胞的分化中也起核心作用，是Tfh細胞的亞群決定因子[2].

2 Bcl-6在Tfh細胞分化過程中發(fā)揮核心作用

CD4+T細胞，又稱Th細胞(T helper cell， 輔助性T細胞)，是一類在體內(nèi)發(fā)揮輔助性功能的T細胞，在機體適應(yīng)性免疫反應(yīng)中占據(jù)中心位置.幼稚型CD4+T細胞可以分化為多種亞群，包括Th1，Th2，iTreg(induced regulatory T cells， 誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細胞)，Th17和Tfh等，這些亞群分別調(diào)控了不同的免疫反應(yīng).Tfh細胞是一類以輔助B細胞作為專職功能的CD4+T細胞亞群，其定位在B細胞濾泡中，參與B細胞親和力成熟、抗體同型轉(zhuǎn)換、漿細胞分化、記憶B細胞產(chǎn)生和生發(fā)中心形成等一系列重要生物過程的調(diào)控，對于由抗體介導(dǎo)的體液免疫十分重要[1].自2009年發(fā)現(xiàn)Bcl6是Tfh細胞亞群決定因子后，Tfh細胞被鑒定為除Th1、Th2、Th17和iTreg以外的一類獨立的CD4+T細胞亞群，成為較為公認的第五類獨立CD4+T細胞亞群.

Tfh細胞分化受到精細調(diào)控，多種轉(zhuǎn)錄因子通過正向調(diào)節(jié)或負向調(diào)節(jié)的方式參與這一過程，如Bcl-6，Blimp1，c-MAF， BATF， IRF4， STAT家族蛋白，ASCL2，Klf2等.Bcl-6與Blimp1是一對相互拮抗的轉(zhuǎn)錄因子，Bcl-6驅(qū)動Tfh細胞分化程序，Blimp1抑制Tfh細胞分化，促進其它CD4+T細胞亞群的分化.c-MAF受ICOS(inducible T cell costimulator，誘導(dǎo)共刺激因子)信號誘導(dǎo)表達并促進IL-21的產(chǎn)生.BATF在Th17和Tfh細胞的分化過程中重要，在Tfh細胞中能夠誘導(dǎo)Bcl-6和c-MAF的表達.STAT3，STAT1，STAT4可接收細胞因子信號，在Tfh細胞分化過程中發(fā)揮重要作用.ASCL2通過調(diào)控CXCR5的上調(diào)、PSGL1和CCR7的下調(diào)調(diào)節(jié)Tfh細胞的早期分化.Klf2是一個對Tfh細胞其負向調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，其促進T細胞向T細胞區(qū)而非B細胞濾泡區(qū)遷移.Klf2還可通過上調(diào)Blimp1、T-bet和Gata3等轉(zhuǎn)錄因子的表達抑制Tfh細胞分化[1].

2.1 Bcl-6發(fā)現(xiàn)與Tfh細胞分化調(diào)控

Tfh細胞的命名在2000年被首次提出，用來描述表達CXCR5的CD4+T細胞群，使它們能夠遷移到富含CXCR5的配體CXCL13的生發(fā)中心[3-4].通過對Th1、Th2和Tfh亞群的整體基因表達分析，初步認為Tfh可能代表一個獨特的效應(yīng)細胞譜系.接著，IL-21在Tfh中的重要性被發(fā)現(xiàn)，使用IL-21或IL-21R缺陷小鼠進行的實驗均證實IL-21在Tfh發(fā)育和生發(fā)中心形成中的關(guān)鍵作用[5-6].根據(jù)CD4+T細胞獨立亞群鑒定的研究范式，接下來的問題是確定驅(qū)動Tfh細胞命運的專一性轉(zhuǎn)錄因子.2009年，董晨課題組、Carola Vinuesa課題組和Shane Crotty課題組的三個獨立研究均鑒定出Bcl-6為Tfh細胞的亞群決定因子，通過功能獲得和功能缺失方法，這些研究人員得出了相同的結(jié)論，即Bcl-6是驅(qū)動Tfh細胞分化所必需和充分的[7-9].在Bcl-6缺陷的情況下，Tfh分化幾乎被完全抑制，而其它的CD4+T細胞亞群的分化基本不受影響；在小鼠體內(nèi)實驗中過表達Bcl-6能夠驅(qū)動Tfh分化.自此，Tfh細胞作為一類獨立的CD4+T細胞亞群的地位得到確立[10].

2.2 Tfh細胞中Bcl-6的功能

Bcl-6參與Tfh分化的多個過程，起到調(diào)控整個分化程序的作用.Bcl-6對有利于向Th1、Th2、Th17方向分化的基因具有抑制作用，驅(qū)動幼稚型CD4+T細胞往Tfh細胞方向分化[11].例如，Bcl-6和Blimp1在B細胞和CD8+、CD4+T細胞分化過程中互相抑制，進而影響細胞分化.Blimp1可以有效抑制Tfh分化，且其在Tfh細胞之外的其它亞群均表達較強，這暗示在Tfh分化過程中Bcl-6通過抑制Blimp1的表達發(fā)揮調(diào)控功能.Bcl-6還可以通過抑制T-bet和RORγt的表達，負向調(diào)控Τh1和Τh17的分化[1].TCR下游分子AP1通過調(diào)控免疫反應(yīng)初期T細胞的信號傳導(dǎo)，促進Th1、Th2和Th17細胞分化，但研究顯示Bcl6可以被AP1招募，抑制AP1信號，進而抑制上述細胞分化[12].同時，在各亞群分化相關(guān)基因的調(diào)節(jié)區(qū)域均存在Bcl-6結(jié)合序列，這提示Bcl-6對其它亞群的分化具有抑制作用.IL-6和IL-21受體的表達可以被Bcl-6調(diào)控，暗示了在免疫反應(yīng)早期Bcl-6可以通過提升Tfh細胞分化信號的響應(yīng)性起始分化.有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-6-Tfh細胞存在于生發(fā)中心內(nèi)，其CCR7、KLF2、S1P1等遷移相關(guān)蛋白顯著高于Bcl-6+的Tfh細胞，這提示Bcl-6+Tfh細胞可能離開生發(fā)中心.另外，Bcl-6還可能參與記憶Tfh細胞的形成[10].

雖然Bcl-6對于Tfh細胞的分化、發(fā)育及功能至關(guān)重要且受到廣泛研究，但對于其具體的作用機制仍有很多不清楚的地方.其中一個問題是Bcl-6作為功能抑制性的轉(zhuǎn)錄因子是如何促進Tfh細胞中基因上調(diào).為了解釋這一問題，Shane Crotty課題組進行了一系列的實驗，發(fā)現(xiàn)Bcl-6通過“雙重抑制回路”來調(diào)控Tfh細胞，即Bcl-6通過雙重抑制的作用模式對Tfh細胞轉(zhuǎn)錄譜進行調(diào)節(jié)，它關(guān)閉了Tfh細胞中發(fā)揮抑制作用的重要基因的表達，最終實現(xiàn)Tfh細胞分化和維持過程中關(guān)鍵基因的上調(diào)[13].此外，清華大學(xué)祁海課題組對Bcl-6對Tfh細胞和生發(fā)中心的調(diào)控機制方面提供了新的見解，其最新研究發(fā)現(xiàn)Bcl-6可通過調(diào)控Tfh細胞中的鈣信號傳遞，調(diào)節(jié)Tfh與B細胞之間的突觸黏附相互作用，并可通過非T細胞自主的方式維持Tfh細胞特征[14].

3 Tfh細胞中調(diào)控Bcl-6表達的分子機制

由于Bcl-6在Tfh分化和功能過程中的核心作用，其表達受到精密的調(diào)控.在Tfh細胞中，多種因子參與Bcl-6的表達調(diào)控，包括細胞因子、共刺激分子、轉(zhuǎn)錄因子等(圖1).

圖1 Bcl-6在Tfh細胞中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3.1 細胞因子

參與調(diào)節(jié)Bcl-6的細胞因子主要包括IL-6，IL-21，IL-12，IL-2，分別通過IL-6-STAT3/STAT1信號通路，IL-21-STAT3信號通路，IL-12-STAT4信號通路，IL-2-STAT5-Blimp1信號通路介導(dǎo).IL-6和IL-21是刺激Tfh分化的關(guān)鍵細胞因子，IL-6在體外分化的條件下誘導(dǎo)Tfh的標志基因，在體內(nèi)實驗條件下也能促進Tfh分化[15].在Tfh分化早期如果缺乏IL-6信號刺激，Tfh分化會發(fā)生缺陷.STAT3是經(jīng)典的IL-6下游STAT家族分子，在Tfh中STAT1能與STAT3共同調(diào)節(jié)Bcl-6.IL-21同樣能促進Tfh.關(guān)于IL-21在Tfh中的作用目前仍存在爭議，有的研究發(fā)現(xiàn)IL-21對于Tfh的作用是T細胞內(nèi)在性的，而另一些研究證明IL-21對于Tfh的影響是依賴B細胞的.最近的研究發(fā)現(xiàn)，IL-21能夠抑制Tfr (follicular regulatory T cells， 濾泡調(diào)節(jié)性細胞)，使GC中Tfh對Tfr的比例增高.由于在之前的研究中研究者們并未區(qū)分Tfh和Tfr，因此這一研究的發(fā)現(xiàn)可能對IL-21在Tfh中作用機制的進一步研究提供了新的方向[16].

IL-12也能促進Bcl-6的表達.研究表明，IL-12能夠依賴STAT4誘導(dǎo)Bcl-6的表達，增強小鼠體內(nèi)PD-1highCXCR5+Tfh細胞的分化.然而小鼠中STAT4的缺陷不會引起Tfh的缺陷，暗示著STAT4信號通路的缺陷可以被其它信號通路補償.IL-12介導(dǎo)的STAT3激活可能補償STAT4的缺陷，或者IL-6介導(dǎo)的STAT1和STAT3提供了STAT4缺陷后的所需的Tfh分化信號[17].與小鼠Tfh分化中IL-12所起的相對較弱的作用不同，人類Tfh細胞的分化主要由IL-12-STAT4信號通路調(diào)控.

IL-2在T細胞增殖、存活、分化和凋亡等過程中都起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)在Tfh細胞中IL-2抑制Bcl-6表達.早期的研究認為IL-2是免疫系統(tǒng)中重要的保護性細胞因子，然而隨著IL-2在Treg中功能的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究認為IL-2作為機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持者發(fā)揮作用.在Tfh中，IL-2Rα的缺失或減少導(dǎo)致T細胞內(nèi)在性的Tfh增多，而過量IL-2能夠抑制Tfh的分化.與Tfh高量表達Bcl-6類比，非Tfh細胞表達高量的Blimp1，Bcl-6和Blimp1能夠相互拮抗，導(dǎo)致CD4+T細胞向Tfh或非Tfh方向分化.過量的IL-2信號通路能夠通過激活STAT5增強Blimp1的表達，同時抑制Bcl-6的表達.此外，激活的STAT5可通過替代STAT3在Bcl-6基因位點上的結(jié)合抑制Tfh細胞的分化.最近的研究發(fā)現(xiàn)，IL-6/IL-21-STAT3信號通路可誘導(dǎo)ECM1(extracellular matrix protein 1， 細胞外基質(zhì)蛋白1)在Tfh細胞中的高量表達，再通過ECM1對IL-2-STAT5信號通路的抑制作用最終促進Bcl-6的表達[18].

3.2 轉(zhuǎn)錄因子

與Tfh分化相關(guān)的其他轉(zhuǎn)錄因子也參與Bcl-6的調(diào)控，如TCF1、BATF、Thpok和LEF1等.研究發(fā)現(xiàn)，BATF直接與Bcl-6的啟動子結(jié)合[19].LEF1和TCF1不僅能直接與Blimp1和Bcl-6的啟動子結(jié)合，調(diào)控Tfh發(fā)育，而且能提升ICOS和IL-6的表達，通過放大其在免疫反應(yīng)早期介導(dǎo)的Tfh發(fā)育信號以進一步誘導(dǎo)Bcl-6表達.此外，TCF1的亞基P33可以與Bcl-6互作來解除Bcl-6對其自身的抑制[9， 20-21].Thpok是最近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控Bcl-6的轉(zhuǎn)錄因子，其與Bcl-6第一個內(nèi)含子結(jié)合，促進Bcl-6轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)Tfh分化[22].

3.3 共刺激信號

Tfh分化是一個多步驟、多種細胞參與的復(fù)雜過程，需要不同的共刺激信號參與，其中CD28和ICOS尤為重要.CD28在Tfh 的早期發(fā)育和后期的維持中均起重要作用[23].而另一項在器官移植中的研究發(fā)現(xiàn)，中止CD28信號可以有效的抑制移植受體針對供體器官產(chǎn)生Tfh細胞和抗體，說明CD28在Tfh分化中的重要作用[24].ICOS和CD28均可以刺激PI3K通路，而PI3K信號通路介導(dǎo)了ICOS信號通路對于Bcl-6的誘導(dǎo).因此，CD28可能是Tfh發(fā)育中Bcl-6的誘導(dǎo)信號.在OVA蛋白介導(dǎo)OT-II細胞免疫反應(yīng)的初期，CD28或ICOS信號的缺失會影響早期Tfh的發(fā)育，但可能只有CD28會影響B(tài)cl-6的誘導(dǎo)表達，而ICOS只是略微影響了CXCR5的水平，但對于Tfh的維持重要[25].然而，另一項利用LCMV急性病毒感染模型的研究卻發(fā)現(xiàn)早期Bcl-6的誘導(dǎo)嚴重依賴ICOS信號[26].這種矛盾可能是由于不同免疫模型中對于“發(fā)育早期”的具體時間定義不一致導(dǎo)致的.另外一項研究發(fā)現(xiàn)，ICOS不僅參與Bcl-6的誘導(dǎo)，還可以通過其下游蛋白影響B(tài)cl-6的翻譯后修飾.研究者們發(fā)現(xiàn)由ICOS信號誘導(dǎo)的骨橋蛋白通過與Bcl-6相互結(jié)合抑制Bcl-6的降解[27].另外，董晨課題組的最新研究發(fā)現(xiàn)共刺激分子可通過差異性地調(diào)節(jié)ERK-Zfp831軸來塑造T濾泡輔助細胞的分化.與CD28相比，ICOS缺乏激活ERK的能力，而Zfp831是一個受ERK通路抑制表達的轉(zhuǎn)錄因子，通過直接上調(diào)Bcl-6和TCF7的表達來促進Tfh細胞分化[28].

4 Bcl-6的其它分子調(diào)控機制

4.1 表觀遺傳學(xué)調(diào)控

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2可受到轉(zhuǎn)錄因子TCF1的招募，降低包括Bcl-6在內(nèi)的與Tfh發(fā)育相關(guān)的多個基因的甲基化水平，進而提高它們的轉(zhuǎn)錄活性[29].在另一項研究中，陸軍軍醫(yī)大學(xué)葉麗林課題組同樣發(fā)現(xiàn)了EZH2通過促進Tfh細胞維持其亞群特異性的染色質(zhì)模式，在Tfh細胞早期命運決定中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30].董晨課題組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Tox2通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)可及性驅(qū)動Tfh發(fā)育[31].另外，H3K36me2甲基轉(zhuǎn)移酶Nsd2被發(fā)現(xiàn)是Tfh分化的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)節(jié)劑.Nsd2的表達在早期被CD28信號迅速誘導(dǎo)，并在后期受到ICOS信號調(diào)節(jié)，以維持其持續(xù)表達并對Tfh細胞進行調(diào)控[32].中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院陸前進課題組發(fā)現(xiàn)E4BP4通過招募抑制性表觀遺傳修飾因子組蛋白去乙?；窰DAC1和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2來調(diào)控Bcl-6的轉(zhuǎn)錄.在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病人中E4BP4磷酸化受損，且這種受損的轉(zhuǎn)錄因子引起的Tfh細胞功能受損與系統(tǒng)性紅斑狼瘡中不受控的自身免疫反應(yīng)正相關(guān)[33].

4.2 代謝調(diào)控

最近的研究發(fā)現(xiàn)在Tfh細胞中mTORC1通過mTORC1-4E-BP-eIF4E信號通路參與Bcl-6的表達調(diào)控[34].另外值得注意的是，在Tfr細胞(follicular regulatory T cell，濾泡調(diào)節(jié)性T細胞)中mTORC1-STAT3-TCF1信號通路調(diào)控了Bcl-6表達[35].

4.3 激酶分子

最近的研究發(fā)現(xiàn)，Prkd2(serine/threonine-protein kinase D2，絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶D2)可直接與Bcl-6結(jié)合，Prkd2使Bcl-6磷酸化并抑制Bcl-6進入細胞質(zhì)，進而抑制Tfh細胞分化.然而Bcl-6也可抑制Prkd2的表達，因此Prkd2和Bcl-6形成一個相互抑制的正反饋回路，調(diào)控Tfh分化[36].

5 總結(jié)與展望

Tfh細胞作為一群最新鑒定的獨立CD4+T細胞亞群，參與多種疾病的發(fā)病過程，如自身免疫性疾病、感染性疾病、過敏、動脈粥樣硬化、器官移植和癌癥等，并與疫苗的有效性密切相關(guān)[37-38].在最近發(fā)生的新型冠狀病毒肺炎中，也發(fā)現(xiàn)病人脾臟和淋巴結(jié)中表達Bcl-6的Tfh細胞和生發(fā)中心的明顯缺失，為冠狀病毒感染后產(chǎn)生的有限中和抗體反應(yīng)提供了一種機制解釋[39].Bcl-6是Tfh細胞的亞群決定因子，在Tfh細胞分化、發(fā)育和發(fā)揮功能的各方各面都起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用.因此，Tfh細胞中存在多種因子參與Bcl-6的分子調(diào)控，包括細胞因子、共刺激分子、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾酶等，而這些分子通過影響B(tài)cl-6進一步調(diào)節(jié)了Tfh細胞.通過Bcl-6調(diào)節(jié)Tfh相關(guān)的免疫反應(yīng)已在小鼠模型中被證明能夠控制流感引起的疾病反應(yīng)[18]，針對Bcl-6分子調(diào)控更深入的理解將幫助更好地通過開啟或關(guān)閉Bcl-6控制免疫反應(yīng)，進而應(yīng)用于疾病預(yù)防和治療.

除了在Tfh細胞和生發(fā)中心B細胞中作為亞群決定因子發(fā)揮重要作用外，Bcl-6在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)還扮演多個角色.例如，Bcl-6可促進CD4+記憶T細胞和中央記憶CD8+T細胞產(chǎn)生[2].另外，Bcl-6在其它CD4+T細胞亞群中也可發(fā)揮獨特功能.在Th1細胞中，Bcl-6與Th1細胞亞群決定因子T-bet協(xié)作，共同調(diào)控Th1細胞中多種基因的表達[40].

長期以來，Bcl-6作為抑制性轉(zhuǎn)錄分子如何控制Tfh細胞中基因譜表達一直是個謎題，最近這一問題已經(jīng)基本得到解決，即Bcl-6通過“雙重抑制回路”調(diào)控Tfh細胞[13].除本文中主要闡述的Bcl-6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，翻譯后修飾對于Bcl-6的表達調(diào)控也起重要作用.例如，研究表明廣譜去泛素化酶抑制劑處理可引起CD4+T細胞中Bcl-6蛋白量升高[27]，暗示泛素化修飾在Bcl-6調(diào)控過程中發(fā)揮作用.針對Bcl-6的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平調(diào)控的研究目前還比較缺乏，是一個未來值得探討的方向.