單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)展及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用革新

宋金益，胡海洋

（中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198）

自2009年第一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Single-cell RNA sequenc ing，sc RNA-seq）技術(shù)問(wèn)世以來(lái)[1]，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序已日漸成為生物醫(yī)學(xué)研究的新范式。基于整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的大量數(shù)據(jù)，scRNA-seq以極高的分辨率提供了有關(guān)基因表達(dá)及其調(diào)控的全面信息，從而能夠精準(zhǔn)地描述細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)。近幾年，隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在靈敏度和精確性方面不斷被改良，不僅可以更高效、更低成本地提供全面的生物信息，同時(shí)也使更精確地解析單個(gè)細(xì)胞的增殖分化、衰老以及病變過(guò)程成為現(xiàn)實(shí)。單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的革新正在帶來(lái)一場(chǎng)細(xì)胞檢測(cè)、分類(lèi)和鑒定的方法學(xué)革命，其應(yīng)用范圍從早期胚胎發(fā)育擴(kuò)大到組織器官發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫和腫瘤等多個(gè)重要領(lǐng)域。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基本流程可以概括為單細(xì)胞捕獲、mRNA提取與逆轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等。目前，主流的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)包括10X Genomics Chromium、Nadia（Dolomite Bio）、BD Rhapsody Single-Cell Analysis System、Illumina Bio-Rad、Fluidigm C1等。雖然scRNA-seq的新平臺(tái)仍在不斷涌現(xiàn)，但使用最廣泛的平臺(tái)仍然是基于Drop-seq測(cè)序技術(shù)的10X Genomics Chromium[2]，其測(cè)序流程如圖1所示。具體如下：從組織中分離細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液；將每個(gè)細(xì)胞與具有明顯條形碼的微珠共同封裝在納升級(jí)液滴中；分離液滴，裂解細(xì)胞；微珠捕獲細(xì)胞的mRNA，形成STAMPs（Single-cell Transcriptomes Attached to Microparticles)；在一個(gè)反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測(cè)序數(shù)千個(gè)STAMP；使用Barcode獲取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞來(lái)源。

圖1 高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Drop-seq）工作流程

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展與革新

2.1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與方法學(xué)開(kāi)發(fā)

吳昊等[3]開(kāi)發(fā)的scNT-seq（single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）技術(shù)可以大規(guī)模并行分析來(lái)自同一細(xì)胞的已存在和新轉(zhuǎn)錄mRNA。CAO等[4]開(kāi)發(fā)的sci-fate可以用于研究單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)。MOUDGIL等[5]介紹了一種在不同細(xì)胞系以及小鼠體內(nèi)可以同時(shí)捕捉基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的單細(xì)胞測(cè)序方法scCC（single-cell calling cards）。

DUAN等[6]開(kāi)發(fā)了基于人工智能度量學(xué)習(xí)的單細(xì)胞類(lèi)型鑒定新方法scLearn。NITZAN等[7]首次利用生物學(xué)假設(shè)和數(shù)學(xué)優(yōu)化模型，提出完全獨(dú)立于參考數(shù)據(jù)的單細(xì)胞空間位置從頭推斷策略。MA等[8]介紹了一種scRNA-seq差異表達(dá)基因和基因富集聯(lián)合分析的計(jì)算方法iDEA。LANGE等[9]建立了包括再生、重編程以及疾病發(fā)生過(guò)程等發(fā)展方向未知的單細(xì)胞命運(yùn)映射工具CellRank。

2.2 單細(xì)胞染色質(zhì)可及性技術(shù)與單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

在單細(xì)胞水平分析染色質(zhì)可及性可以提供復(fù)雜組織內(nèi)細(xì)胞類(lèi)型組成和細(xì)胞間變異的關(guān)鍵信息。LI等[10]開(kāi)發(fā)了基于流式分選并利用熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)座酶插入細(xì)胞染色質(zhì)的測(cè)序方法 ftATAC-seq（fluorescent tagmentation-and FACS-sorting-based scATAC-seq）。陳曦等[11]詳細(xì)描述了一項(xiàng)基于流式細(xì)胞分選和384孔板的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性技術(shù)。

BODENMILLER等[12]使用大規(guī)模高維單細(xì)胞質(zhì)譜成像分析技術(shù)，確定了腫瘤和基質(zhì)單細(xì)胞的表型、組織和異質(zhì)性，并能夠根據(jù)細(xì)胞組成和組織來(lái)表征乳腺癌組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。BAYRAKTAR團(tuán)隊(duì)[13]開(kāi)發(fā)的新工具Cell2location可對(duì)不同組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)空間轉(zhuǎn)錄組分析。

2.3 單細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)

除了探索單細(xì)胞的分子特征，采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還能通過(guò)譜系示蹤研究細(xì)胞的正常或疾病狀態(tài)[14-15]。PEI等[16]報(bào)告了人工DNA重組基因座，即Polylox條形碼，成功實(shí)現(xiàn)在高分辨率水平重建細(xì)胞發(fā)育軌跡以及在克隆水平揭示細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)。2020年，PEI等[17]在Polylox系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，將DNA條形碼表達(dá)為RNA條形碼，實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平整合細(xì)胞譜系信息與基因表達(dá)信息。

2.4 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與多組學(xué)結(jié)合

將RNA雜交、蛋白質(zhì)免疫組織化學(xué)、原位測(cè)序、質(zhì)譜等技術(shù)與單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)等進(jìn)一步整合，可以在時(shí)間和空間上實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的檢測(cè)[18]。

任兵團(tuán)隊(duì)[19]報(bào)道了利用Methyl-HiC技術(shù)可使DNA甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定同步進(jìn)行成為現(xiàn)實(shí)。MIMITOU等[20]開(kāi)發(fā)了一種能夠同時(shí)檢測(cè)單細(xì)胞蛋白質(zhì)水平和染色質(zhì)可及性的方法PHAGE-ATAC。任兵團(tuán)隊(duì)[21]開(kāi)發(fā)了單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)Paired-Tag，利用該技術(shù)可在單個(gè)細(xì)胞中對(duì)組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聯(lián)合分析。YANAI等[22]將基于微陣列的空間轉(zhuǎn)錄組方法和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組2種技術(shù)結(jié)合起來(lái)，并將多模式交叉分析應(yīng)用于原發(fā)性胰腺腫瘤。

3 基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用革新

3.1 大規(guī)模組織器官圖譜

郭國(guó)驥等[23]利用簡(jiǎn)單低成本的Microwell-seq高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，對(duì)來(lái)自小鼠的40萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了首個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞圖譜。這一單細(xì)胞組學(xué)領(lǐng)域里程碑式的研究成果，推動(dòng)了單細(xì)胞測(cè)序在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域的普及。2020年，郭國(guó)驥團(tuán)隊(duì)[24]又對(duì)60種人體組織類(lèi)型的樣本進(jìn)行高通量單細(xì)胞測(cè)序分析，系統(tǒng)地繪制了包含8大系統(tǒng)的人類(lèi)細(xì)胞圖譜，同時(shí)對(duì)人和小鼠的景觀進(jìn)行了單細(xì)胞比較分析，確定了保守的遺傳網(wǎng)絡(luò)。

3.2 神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的應(yīng)用革新

大腦皮層是高級(jí)認(rèn)知的中樞，是人類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中大腦中擴(kuò)張和多樣化最多的區(qū)域。SESTAN等[25]通過(guò)跨物種單細(xì)胞數(shù)據(jù)整合分析、免疫染色分析以及重新分析已發(fā)表的數(shù)據(jù)，證明了成年人腦中神經(jīng)元生成非常罕見(jiàn)甚至并不存在。KRIEGSTEIN團(tuán)隊(duì)[26]利用單細(xì)胞測(cè)序，通過(guò)分析神經(jīng)發(fā)生的高峰階段和早期膠質(zhì)發(fā)生期間的10個(gè)主要大腦結(jié)構(gòu)和6個(gè)新皮質(zhì)區(qū)域，揭示了不同皮層區(qū)域不同細(xì)胞縱向發(fā)育的分子圖譜?，F(xiàn)有的人類(lèi)腦細(xì)胞圖譜還未涉及腦血管系統(tǒng)，而腦血管疾病是引發(fā)死亡和神經(jīng)功能障礙的重要原因，NOWAKOWSKI團(tuán)隊(duì)[27]通過(guò)分析約18萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，成功繪制了成人腦血管系統(tǒng)的細(xì)胞圖譜。

3.3 免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用革新

錢(qián)俊斌等[28]繪制了一份全面的COVID-19肺炎免疫圖譜，通過(guò)分析患有輕度或危重疾病的COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗樣本以及非COVID-19肺炎患者樣本，為區(qū)分COVID-19特異性相關(guān)免疫變化的肺局部炎癥信號(hào)提供參考。CD8+T細(xì)胞是殺傷癌細(xì)胞的最主要細(xì)胞類(lèi)群，但在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，這些T細(xì)胞呈現(xiàn)功能失調(diào)狀態(tài)，即T細(xì)胞耗竭。張澤民團(tuán)隊(duì)[29]對(duì)來(lái)自300多名患者的21種癌癥類(lèi)型的T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，確定了不同T細(xì)胞類(lèi)型轉(zhuǎn)錄物組成的差異。

3.4 在發(fā)育生物學(xué)和胚胎學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用革新

在人類(lèi)妊娠早期，子宮黏膜轉(zhuǎn)變?yōu)橥懩?，胎兒胎盤(pán)被植入其中，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體細(xì)胞混合并交流；滋養(yǎng)層-蛻膜相互作用異常是妊娠常見(jiàn)疾病的基礎(chǔ)，包括先兆子癇和死產(chǎn)。英國(guó)劍橋桑格研究所[30]通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序分析了來(lái)自孕早期胎盤(pán)的約7萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與相匹配的母體血液和蛻膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，構(gòu)建了人類(lèi)蛻膜-胎盤(pán)的詳細(xì)分子和細(xì)胞圖譜。LUNDEBERG等[31]以受孕后10周內(nèi)的3個(gè)發(fā)育階段的人類(lèi)心臟樣本為研究對(duì)象，綜合利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RNA原位雜交等實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及細(xì)胞空間概率分型的計(jì)算方法，首次從全器官尺度繪制了人類(lèi)心臟發(fā)育的單細(xì)胞基因表達(dá)空間圖譜。CAMP團(tuán)隊(duì)[32]成功繪制了呼吸道和胃腸道的多個(gè)發(fā)育中內(nèi)胚層器官的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。ROY等[33]通過(guò)比較來(lái)自5個(gè)不同組織的57 489個(gè)造血干/祖細(xì)胞，跨越人類(lèi)一生的4個(gè)發(fā)育階段，揭示了人類(lèi)發(fā)育過(guò)程中肝臟和骨髓的造血干/祖細(xì)胞的高分辨率單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。

湯富酬團(tuán)隊(duì)[34]在人類(lèi)胚胎和胎兒發(fā)育過(guò)程中對(duì)4個(gè)皮質(zhì)葉和腦橋進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)鑒定了人類(lèi)胚胎發(fā)育關(guān)鍵階段的8種主要細(xì)胞類(lèi)型及其亞型。MICHAELA等[35]綜合利用scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組和原位測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)地描述了在妊娠前3個(gè)月3個(gè)發(fā)育階段的人類(lèi)心臟的空間原型和細(xì)胞異質(zhì)性。MEISTERMANN等[36]明確人類(lèi)胚胎中譜系規(guī)范事件的精確時(shí)間以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和細(xì)胞命運(yùn)標(biāo)志物。

3.5 腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用革新

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于癌癥領(lǐng)域，揭示了腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變、克隆進(jìn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。LOCASALE課題組[37]首次通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)解析了黑色素瘤和頭頸癌微環(huán)境中的代謝基因表達(dá)圖譜，并確定了不同免疫和基質(zhì)細(xì)胞亞型的代謝特征。MAYNARD等[38]首次在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組層面上對(duì)肺癌患者在治療之前和治療期間的腫瘤樣本進(jìn)行了橫向及縱向?qū)Ρ?，產(chǎn)生的癌癥和腫瘤微環(huán)境單細(xì)胞圖譜揭示了豐富而動(dòng)態(tài)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。ZHANG等[39]對(duì)結(jié)直腸癌患者的免疫和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序分析，同時(shí)對(duì)人和小鼠關(guān)鍵骨髓亞群進(jìn)行綜合分析，確定了調(diào)節(jié)腫瘤免疫的關(guān)鍵細(xì)胞間的相互作用，并揭示了目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的骨髓靶向免疫療法的潛在機(jī)制。

張澤民團(tuán)隊(duì)[40]對(duì)跨組織分布的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的組成、譜系和功能狀態(tài)的鑒定，有助于進(jìn)一步了解肺癌中T細(xì)胞的功能狀態(tài)和動(dòng)力學(xué)。MERAD等[41]綜合利用scRNA-seq、CITE-seq和TCR-seq技術(shù)，對(duì)35個(gè)非小細(xì)胞肺癌病人的病灶腫瘤與非肺部組織進(jìn)行分析，成功構(gòu)建了早期肺癌免疫反應(yīng)細(xì)胞圖譜。閻新龍團(tuán)隊(duì)[42]明確了人類(lèi)肝內(nèi)膽管癌的腫瘤間異質(zhì)性，強(qiáng)調(diào)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞和血管癌相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞間通信的重要性，同時(shí)揭示了潛在的治療靶點(diǎn)。MILES等[43]對(duì)髓系惡性腫瘤患者樣本進(jìn)行了單細(xì)胞突變分析，對(duì)髓系細(xì)胞的惡化機(jī)制以及克隆復(fù)雜性在疾病進(jìn)程中的變化進(jìn)行了闡述。

4 總結(jié)與展望

利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可準(zhǔn)確度量單個(gè)細(xì)胞內(nèi)生物信息，技術(shù)的不斷革新進(jìn)一步推動(dòng)了單細(xì)胞水平的生理過(guò)程和病理機(jī)制的解析與發(fā)現(xiàn)，從而為尋找新的診斷標(biāo)志物或新的治療靶點(diǎn)提供重要基礎(chǔ)，也為提高疾病的診斷和治療水平提供潛在的實(shí)踐依據(jù)。

本綜述介紹了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的原理、測(cè)序技術(shù)的革新以及不斷涌現(xiàn)的單細(xì)胞測(cè)序新技術(shù)，如單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)等；同時(shí)涵蓋了單細(xì)胞測(cè)序方法在神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育生物學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤領(lǐng)域等方面的創(chuàng)新性應(yīng)用，凸顯了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在高度異質(zhì)性單細(xì)胞研究中的巨大優(yōu)勢(shì)。與此同時(shí)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)仍存在操作煩瑣、檢測(cè)成本高等實(shí)際問(wèn)題，限制了技術(shù)被更廣泛應(yīng)用與推廣。此外，單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域在從單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中獲取生物信息內(nèi)容和質(zhì)量等方面仍然有需要克服的技術(shù)和計(jì)算限制，同時(shí)單細(xì)胞多組學(xué)分析的應(yīng)用仍處于早期階段，仍有許多方向有待探索，并且有相當(dāng)多的發(fā)展機(jī)會(huì)。