安石榴苷通過Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路對(duì)幼齡哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王 瑩 王榮環(huán) 謝 意

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科 天津 300211

哮喘是兒童慢性呼吸道疾病，慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性是其主要特征，氣道重塑是其最重要的病理性特點(diǎn)［1，2］。一線藥物吸入型糖皮質(zhì)激素能改善兒童哮喘癥狀，但不能改變疾病進(jìn)程并預(yù)防哮喘復(fù)發(fā)［3，4］。氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth mus?cle cell，ASMC）其惡性增殖是氣道重塑的重要基礎(chǔ)［5］。蛋 白 激 酶B（protein kinase B，Akt）/核 因子?κB（nuclear factor?κB，NF?κB）/細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）通路是炎癥引發(fā)細(xì)胞增殖的重要途徑，Akt 磷酸化后可激活NF?κB，導(dǎo)致NF?κB 磷酸化后調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，同時(shí)上調(diào)Cyclin D1 表達(dá)，加快細(xì)胞周期進(jìn)程［6，7］。安石榴苷是從石榴果皮中提取的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等作用［8］。研究顯示，安石榴苷能緩解慢性支氣管炎大鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)，但對(duì)哮喘的影響尚無人研究［9］。本研究將探究安石榴苷對(duì)幼齡哮喘大鼠ASMC 增殖、凋亡及Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路的影響，以期為治療兒童哮喘提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 周齡SD 雄性大鼠，體質(zhì)量90～100 g，購(gòu)自肇慶市瑞思元生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（粵）2020?0053。在溫度20～25 ℃、自由飲食飲水條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鋁、卵白蛋白、Annexin V?FITC/PI 試劑盒（北京百奧萊博）；安石榴苷、HE試劑盒、CCK?8 試劑（北京索萊寶）；兔抗p?Akt、兔抗Akt、兔抗NF?κB p?p65、兔抗NF?κB p65、兔 抗Cy?clin D1、兔抗GAPDH、山羊抗兔（杭州戴格公司）。

1.1.3 主要儀器 AH?2 型顯微鏡（日本Olym?pus）；SynergyH 1 型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）；BD FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD）；Alpha View 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與哮喘大鼠模型制備 幼齡大鼠隨機(jī)分為正常組、哮喘組和安石榴苷低、中、高劑量組，每組10 只。按照文獻(xiàn)［10］制備哮喘模型，出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌抽搐、呼吸急促及站立不穩(wěn)等現(xiàn)象代表哮喘模型建立成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)給藥 于激發(fā)過程第1 天開始給藥，安石榴苷低、中、高劑量組灌胃10、20、40 mg/kg 安石榴苷［9］，正常組、哮喘組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)4 周。

1.2.3 大鼠一般情況觀察 給藥結(jié)束后24 h 內(nèi)，記錄幼齡大鼠體質(zhì)量及臨床癥狀，測(cè)定肺功能，計(jì)算出大鼠最大呼氣流量（peak expiratory flow，PEF）及0.2 秒用力呼氣容積占用力肺活量比率（ratio of forced expiratory volume at 0.2 second and forced vi?tal capacity，F(xiàn)EV0.2/FVC）。

1.2.4 HE 染色觀察大鼠肺組織學(xué) 給藥結(jié)束后24 h 內(nèi)將大鼠處死取材。開胸迅速分離肺組織，右側(cè)肺組織以液氮凍存待檢；左側(cè)肺組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，厚度5 μm，HE 染色觀察。

1.2.5 哮喘大鼠ASMC 的分離、培養(yǎng)及分組 取1只哮喘模型大鼠，用10%水合氯醛（40 mg/kg）麻醉，在無菌條件下分離氣道平滑肌組織，組織貼壁法培養(yǎng)ASMC，差速貼壁法純化細(xì)胞［11］，在含20%胎牛血清及雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代。

取第5 代ASMC 5×104個(gè)/mL 接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，分為對(duì)照組和安石榴苷低、中、高濃度組，分別加入0、100、200、400 μmol/L 的安石榴苷［12］。

1.2.6 CCK?8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入10 μL CCK?8 試劑，培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)450 nm）檢測(cè)各孔吸光度（A）值。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并用結(jié)合緩沖液調(diào)整為1×106個(gè)/mL，按Annexin V?FITC/PI 試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 Western Blot 檢測(cè)肺組織、ASMC 中Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)48 h 后的ASMC，提取右側(cè)肺組織及細(xì)胞中總蛋白，BCA 法定量，10% SDS?PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后封閉1 h，加入一抗（兔抗p?Akt、兔抗Akt、兔抗NF?κB p?p65、兔抗NF?κB p65、兔抗Cy?clin D1、兔抗GAPDH，均1∶100），4 ℃孵育過夜，加入二抗（山羊抗兔，1∶2 000）孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 幼齡大鼠一般情況圖1 顯示，與正常組相比，哮喘組體質(zhì)量、PEF、FEV0.2/FVC 降低；與哮喘組相比，安石榴苷低、中、高劑量組體質(zhì)量、PEF、FEV0.2/FVC 升高，且呈劑量依賴（P<0.05）。

圖1 各組體質(zhì)量、PEF、FEV0.2/FVC 的比較

2.2 肺組織學(xué)觀察正常組肺組織黏膜上皮完整，支氣管管腔及肺泡形態(tài)規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及氣管平滑肌增厚現(xiàn)象；哮喘組肺組織黏膜上皮破損，可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及明顯的氣管平滑肌增厚；安石榴苷低、中、高劑量組肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣管平滑肌增厚情況逐漸減輕（圖2）。

圖2 HE 染色觀察各組肺組織學(xué)情況（×200）

2.3 肺組織中Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況圖3 顯示，與正常組相比，哮喘組肺組織p?Akt/Akt、NF?κB p?p65/NF?κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋白表達(dá)水平升高；與哮喘組相比，安石榴苷 低、中、高 劑 量 組 肺 組 織p?Akt/Akt、NF?κB p?p65/NF?κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋 白表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。

圖3 各組肺組織中蛋白表達(dá)水平

2.4 各組ASMC增殖情況見圖4。與對(duì)照組相比，安石榴苷低、中、高濃度組ASMC 的A值降低；隨著安石榴苷濃度的升高，ASMC的A值降低（P<0.05）。

圖4 各組ASMC 增殖情況（A 值）的比較

2.5 各組ASMC 凋亡情況圖5 顯示，與對(duì)照組相比，安石榴苷低、中、高濃度組ASMC 凋亡率升高，且呈劑量依賴（P<0.05）。

圖5 各組ASMC 凋亡情況及凋亡率比較

2.6 ASMC 中Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況圖6 顯示，與對(duì)照組相比，安石榴苷低、中、高濃度組ASMC 細(xì)胞中p?Akt/Akt、NF?κB p?p65/NF?κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋白表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。

圖6 各組ASMC 的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

哮喘是常見于兒童的慢性呼吸道疾病，為了模擬兒童哮喘，本研究選用幼齡大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并通過氫氧化鋁、卵白蛋白誘導(dǎo)建立幼齡哮喘大鼠模型，成功建立了哮喘大鼠模型。

安石榴苷具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎等多種活性［13］。研究發(fā)現(xiàn)，安石榴甙在脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起抗炎作用［14］。本研究提示安石榴苷可抑制ASMC 增殖并誘導(dǎo)其凋亡，即其可抑制ASMC 的惡性增殖狀態(tài)。Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)程，Akt 通路激活后可通過激活NF?κB，上調(diào)其磷酸化表達(dá)并使其從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，進(jìn)而上調(diào)Cyclin D1 表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組幼齡大鼠肺組織中p?Akt/Akt、NF?κB p?p65/NF?κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋白表達(dá)水平較正常組升高，提示Akt/NF?κB/Cyclin D1 通路參與哮喘發(fā)病過程。使用安石榴苷作用于幼齡哮喘大鼠及其ASMC，可降低肺組織及ASMC 相關(guān)蛋白表達(dá)水平，提示安石榴苷可抑制Akt/NF?κB/Cy?clin D1 通路的激活，可能與抑制ASMC 細(xì)胞惡性增殖進(jìn)而減輕氣道重塑有關(guān)。

綜上所述，安石榴苷可減輕幼齡哮喘大鼠氣道重塑病理狀態(tài)，抑制ASMC 增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制Akt/NF?κB/Cyclin D1通路激活有關(guān)。