堿基編輯技術(shù)在豬基因修飾研究中的應(yīng)用

盤家圣，黃秋艷，楊燁城，楊帥朋，朱向星，唐冬生,

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院/廣東省動物分子設(shè)計與精準(zhǔn)育種重點實驗室，廣東 佛山 528225；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院/廣東省基因編輯工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528225）

生豬養(yǎng)殖是事關(guān)我國國民經(jīng)濟健康發(fā)展和糧食安全的重要產(chǎn)業(yè)。同時，豬由于其機體結(jié)構(gòu)、解剖生理特征等方面與人類相似，因此具有重要醫(yī)學(xué)研究價值。對豬進(jìn)行基因修飾，能夠快速改良其經(jīng)濟性狀，同時還可以構(gòu)建用于生物醫(yī)學(xué)研究的動物模型。傳統(tǒng)基因修飾技術(shù)（如轉(zhuǎn)基因和基因打靶等）雖然已在基因修飾豬研究上應(yīng)用20余年，但實踐表明，傳統(tǒng)豬基因修飾技術(shù)效率低、精度差、周期長、成本高。2020 年Charpentier和Doudna 因成功開發(fā)CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎［1］。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)作為一種革命性的基因修飾技術(shù)，推動了包括豬在內(nèi)的動植物基因修飾進(jìn)程。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)通過在靶點處產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（Double-strand break,DSB），激活胞內(nèi)同源重修復(fù)（Homology directed repair,HDR）或非同源末端連接（Non-homologous end joning,NHEJ）修復(fù)，實現(xiàn)對DNA 的定點插入/刪除或替換［2］。由于具有簡便、高效和經(jīng)濟優(yōu)勢，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于包括豬在內(nèi)的眾多物種上［3-8］。但近年研究表明，CRISPR/Cas9 引發(fā)的DNA 雙鏈斷裂可能導(dǎo)致基因編輯后的細(xì)胞出現(xiàn)不可預(yù)期的情況，如經(jīng)NHEJ 所致的插入/缺失（Indels）不可控，還能引發(fā)脫靶效應(yīng)、基因組大范圍刪除或重排，以及誘導(dǎo)抑癌基因p53 介導(dǎo)DNA 損傷等［9-11］。為了避免DSB 引發(fā)副作用，科學(xué)家開發(fā)出不依賴DSB、僅介導(dǎo)單個堿基突變的基因編輯工具（Base editors,BEs），如腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editors，ABE）和胞嘧啶堿基編輯器（Cytidine base editors，CBE）等［12-13］。研究表明，由于BEs 不介導(dǎo)DSB，能有效避免CRISPR/Cas9 引發(fā)的副作用，使單個堿基定向轉(zhuǎn)換，且具有更高基因編輯精準(zhǔn)性，因而在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［14-22］。

本文對堿基編輯技術(shù)發(fā)展進(jìn)程和堿基編輯技術(shù)介導(dǎo)的人類疾病模型與基因治療、異種器官移植、豬遺傳育種等相關(guān)研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為今后進(jìn)一步利用堿基編輯技術(shù)開展疾病模型構(gòu)建和豬遺傳育種提供理論指導(dǎo)。

1 堿基編輯系統(tǒng)原理與研究進(jìn)展

堿基編輯技術(shù)主要將滅活的或有單鏈切割活性的Cas 蛋白與堿基脫氨酶融合，在sgRNA（guide RNA）的引導(dǎo)下，在不引入DSB、無需供體DNA 的情況下，實現(xiàn)DNA 序列中堿基的定向編輯，提高基因編輯的效率、準(zhǔn)確性和特異性，是加速基因遺傳病治療和動植物遺傳改良的新工具［13］。目前，成熟應(yīng)用的堿基編輯器主要有4 種：CBE，可實現(xiàn)C→T（G→A）突變；ABE，可實現(xiàn)A→G（T→C）突變；CBE/ABE 雙堿基編輯器，可同時實現(xiàn)C→T（G→A）與A→G（T→C）突變；胞嘧啶到鳥嘌呤基礎(chǔ)編輯器（C-to-G base editor,CGBE），可實現(xiàn)C→G 突變［12-13,23-24］。

1.1 胞嘧啶堿基編輯器（CBE）

在胞嘧啶脫氨酶的催化下C 脫氨生成具有T堿基配對性質(zhì)的尿嘧啶U，在堿基修復(fù)（Mismatch repair,MMR）過程中形成A-T 堿基對。Komor等［13］將鼠源的胞嘧啶脫氨酶APOBEC1 融合到無雙鏈切割功能的Cas9 蛋白（dead Cas9,dCas9）的C 端，構(gòu)建了第一代CBE，即BE1；為了進(jìn)一步提高堿基編輯效率，Komor 等將尿嘧啶DNA 糖苷酶抑制因子UGI 融合到BE1 的C 端，并恢復(fù)了Cas9 HNH 結(jié)構(gòu)域的His 殘基，產(chǎn)生第三代堿基編輯器rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI，即BE3（圖1A）。盡管BE3 在編輯效率方面得到不同程度的改善，但其仍存在潛在脫靶效應(yīng)、產(chǎn)物純度不佳的問題，限制了CBE 在生物工程中的應(yīng)用。針對這些缺陷，研究者們對CBE 進(jìn)行不斷改進(jìn)。

BE3 被廣泛用于生物研究中［21,25-37］。但在部分位點上，BE3 可能會產(chǎn)生副產(chǎn)物，其中目標(biāo)C-G堿基對被轉(zhuǎn)換為G-C 或A-T 堿基對，不符合預(yù)期［33-37］。為了進(jìn)一步抑制尿嘧啶DNA 糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase,UNG）活性，Komor 等［38］在BE3 的CAS9 序列C 端附加一個額外的UGI 拷貝，經(jīng)優(yōu)化后形成BE4。與BE3 相比，BE4 在工程細(xì)胞中對C→T 編輯的準(zhǔn)確率大幅增加。為了進(jìn)一步提高編輯效率，Koblan 等［39］在BE4 主要蛋白rAPOBEC1-Cas9 的N 端和C 端分別添加核定位信號（Nuclear localization signal,NLS），再將綠色熒光蛋白基因GFP和2A 肽基因P2A序列連接在rAPOBEC1-Cas9 的C 端，接著優(yōu)化密碼子，最后得到BE4max；同時，該團(tuán)隊在先天性1f 型糖基化障礙疾病治療研究中發(fā)現(xiàn)，BE4max 對致病性SNP 的校正效率為BE4 的2 倍。

CBE 編輯工具在小鼠胚胎中應(yīng)用存在大量非靶點脫靶現(xiàn)象［40］，在植物的應(yīng)用上也發(fā)現(xiàn)類似狀況。Jin 等［41］用BE3、HF1-BE3 和ABE 分別處理水稻，其全基因組測序分析結(jié)果顯示，BE3 和HF1-BE3 誘發(fā)大量全基因組脫靶情況，這些突變大多是C →T 型單核苷酸變種（Single nucleotide variation,SNVs）。隨著蛋白工程技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們進(jìn)一步對CBE 進(jìn)行優(yōu)化以降低其脫靶效應(yīng)。改良的堿基編輯工具YE1-BE4、YE2-BE4、YEE-BE4、R33A+K34A-BE4、YE1-BE4-CP1028、YE1-BE4-NG 和AALN-BE4 在 保持原有靶向堿基編輯活性的同時，能夠最大限度降低DNA 脫靶率［42］。

1.2 腺嘌呤堿基編輯器（ABE）

在CBE 的啟發(fā)下，ABE 應(yīng)運而生。ABE 的原理是腺苷脫氨化會產(chǎn)生肌苷，肌苷在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中被識別為G，從而實現(xiàn)A→G 轉(zhuǎn)換。但自然存在的腺嘌呤脫氨酶不能結(jié)合DNA，學(xué)者試圖研發(fā)一種以DNA 為底物的腺嘌呤脫氨酶。Gaudelli 等［12］采取一種細(xì)菌選擇策略，遴選出1種大腸桿菌源tRNA 腺苷酸脫氨酶（ecTadA）變體，經(jīng)優(yōu)化，ABE7.10 能有效將目標(biāo)A-T 堿基對轉(zhuǎn)換為G-C 堿基對（在人體細(xì)胞中約50%），具有高產(chǎn)物純度（≥99.9%）和低Indels（≤0.1%）的特點，且極少發(fā)生DNA 脫靶現(xiàn)象（圖1B）。

圖1 CBE 和ABE 的作用機制［12-13］Fig.1 Mechanism of CBE and ABE［12-13］

為進(jìn)一步優(yōu)化ABE7.10，Koblan 等［39］用2 個bpNLS 替代ABE7.10 中的SV40 NLS，優(yōu)化其密碼子，得到ABEmax；為了對比ABEmax 與ABE7.10，在HEK293T 細(xì)胞中設(shè)計2 對sgRNA 分別對HBG1 和HBG2 啟動子（γ-globin）區(qū)域激活突變，結(jié)果顯示，對于第1 對sgRNA，ABEmax編輯活性均約為ABE7.10 的2 倍；對于第2 對sgRNA，ABEmax編輯效率分別提高5.2倍和7.1倍。

ABE 顯示出極少的脫靶效應(yīng)，但ABE 對細(xì)胞RNA 的脫靶效應(yīng)尚未得到深入研究。Rees 等［43］證明了ABEmax 在細(xì)胞RNA 中產(chǎn)生了編輯效率低但可檢測到的腺苷到肌苷編輯；為了篩選最小化RNA 編輯活性，Rees 等比較了一系列ABEmax突變體，發(fā)現(xiàn)在TadA 中引入E59A 或E59Q 突變、在TadA*中引入V106W 突變，可保持DNA編輯活性的同時使得RNA 編輯頻率顯著極低。ABEmaxAW 或ABEmaxQW 保持了有效的靶DNA編輯，大大減少了RNA 編輯，提高了DNA 特異性，并減少了Indels 的形成。

1.3 CBE/ABE 雙堿基編輯器

CBE 和ABE 雖然是精準(zhǔn)的基因編輯工具，但只能催化單一類型的核苷酸轉(zhuǎn)換。最近，有兩項研究介紹了一種能同時編輯C 和A 兩種堿基的雙堿基編輯器［23,44］，這種雙堿基編輯系統(tǒng)由nCas9與胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶融合而成，能同時誘導(dǎo)C→T、A→G 突變。雙堿基編輯器的開發(fā)進(jìn)一步拓寬了堿基編輯器的功能（圖2A）。

圖2 ACBE 和CGBE 的作用機制［24,44］Fig.2 Mechanism of ACBE and CGBE

Zhang 等［23］在 ABE7.10 的 N 端添加胞嘧啶脫氨酶 hAID 得到融合體 ABE7.10-N-AID，然后優(yōu)化其密碼子并增加二部核定位信號（bpNLS），添加2 個拷貝的UGI 得到了 A&C-BEmax。在HEK293T 細(xì)胞中試驗28 個內(nèi)源性靶點，A&CBEmax 與ABEmax 相比，A→G 的編輯效率相似或略有降低，而與 AID-BE4max 相比，C →T的編輯效率則有所提高。此外，與同時采用ABEmax 和AID-BE4max 相比，A&C-BEmax 同時引導(dǎo)的A/C 突變率更高。Grunewald 等［44］將腺嘌呤堿基編輯器miniABEmax-V82G 中的腺嘌呤脫氨酶和胞嘧啶堿基編輯器Target-AID 中的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1 分別融合到 nCas9 的N 端和C端，并融入2 個拷貝 UGI，開發(fā)出一種雙堿基編輯器SPACE。SPACE 的C→T 編輯效率與CBE相當(dāng)，對A→G 編輯效率則略有降低，總體來看，SPACE 雙堿基編輯器效率高于CBE+ABE。雙堿基編輯器的開發(fā)解決了同時采用2 個單堿基編輯器的低效編輯問題，能實現(xiàn)更加復(fù)雜的堿基編輯，在動植物遺傳改良、遺傳病模型以及校正疾病相關(guān)等位基因方面具有潛在應(yīng)用價值。

1.4 胞嘧啶到鳥嘌呤基礎(chǔ)編輯器（CGBE）

CBE 和ABE 可分別實現(xiàn)C→T（G→A）、A→G（T→C）的轉(zhuǎn)換，但在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用受限。Kurt 等［24］在研究堿基編輯器時發(fā)現(xiàn)C→G 突變，將BE4max（R33A）刪除2 個UGI，增加1 個大腸桿菌尿嘧啶DNA N-糖基化酶eUNG，形成了CGBE（圖2B），實現(xiàn)C→G（互補鏈為G→C）的轉(zhuǎn)換；通過在人HEK293T細(xì)胞中選取18 個靶點測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGBE 具有高效的C→G 編輯效率（41.7%～71.5%）。為了指導(dǎo)CGBE 應(yīng)用，科學(xué)家們還基于機器學(xué)習(xí)開發(fā)了編輯效率預(yù)測系統(tǒng)，Yuan 等［45］開發(fā)的深度學(xué)習(xí)模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測目標(biāo)位點的CGBE 編輯結(jié)果，為推廣CGBE 提供了助力。雖然CGBE 在工程細(xì)胞中的部分靶點產(chǎn)生了較理想的C→G 編輯效率，突破了堿基顛換編輯的可能，但仍需繼續(xù)探索優(yōu)化，并在特定細(xì)胞、特定基因靶點中進(jìn)一步驗證，以拓展其應(yīng)用范圍。

2 堿基編輯技術(shù)在基因修飾豬模型構(gòu)建中的應(yīng)用

許多人類遺傳病都與SNP 相關(guān)，而堿基編輯技術(shù)為建立單個堿基突變的遺傳病動物模型、異種器官移植以及治療人類遺傳病提供了極大便利。而豬作為遺傳病模型和異種器官移植供體有優(yōu)勢。一方面，豬可以作為鼠和非人靈長類動物疾病模型研究的過渡模型。相比小鼠，豬作為動物模型的優(yōu)勢在于遺傳、身體構(gòu)造和生理特性與人類相似；相比猴子，豬全年可發(fā)情繁殖，而且性成熟時間早，妊娠周期短，產(chǎn)仔數(shù)多，取材容易且飼養(yǎng)難度較低，堿基編輯技術(shù)的面世推動了遺傳疾病模型、異種器官移植、基因療法的研究進(jìn)程。

2.1 異種器官移植供體豬

近年來，人類生活質(zhì)量和醫(yī)療系統(tǒng)的改善大大提高了人類的預(yù)期壽命，但仍存在慢性病和終末期器官衰竭，而器官供體資源緊缺，異種移植被認(rèn)為是一種很有前途的解決方案。但由于抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（Antibody-mediated rejection,AMR）和豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retrovirus,PERV）傳播的潛在風(fēng)險，導(dǎo)致豬器官的臨床應(yīng)用受阻。

pol基因有多個基因拷貝，是豬與人異種器官移植安全性的關(guān)鍵基因之一［46］。敲除pol基因可避免病毒的跨物種感染，可解決異種移植的生物安全問題。Xie 等［21］將BE3 和pol-sgRNA 共轉(zhuǎn)染巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞（Porcine fetal fibroblasts,PFFs），在pol多基因拷貝中提前引入終止密碼子，結(jié)果表明，BE3最高可減少84.9%的PERV拷貝數(shù)，為進(jìn)一步提高對PERV 滅活效率以及生產(chǎn)pol基因精準(zhǔn)修飾豬提供可行性方案。

目前，與AMR 相關(guān)的主要異種抗原包括α-1,3-半乳糖（α-Gal）、豬異種抗原SD（A）和N-羥基神經(jīng)氨酸（Neu5Gc），分別由α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGTA1基因編碼）、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（β4GalNT2基因編碼）和CMPNeu5Ac 羥化酶（CMAH基因編碼）催化合成［47-48］。Yuan 等［49］將BE4-GAM 與GGTA1-sgRNA、B4galNT2-sgRNA 和CMAH-sgRNA 等3 個sgRNA 通過電穿孔法共同轉(zhuǎn)染巴馬豬PFFs，獲得4 個（4/52）三基因編輯單克隆細(xì)胞，結(jié)合體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）技術(shù)，得到1 只三基因精準(zhǔn)修飾的仔豬；免疫熒光試驗（Immuno fluorescence assay,IFA）結(jié)果顯示，與WT 巴馬豬細(xì)胞相比，三基因編輯豬細(xì)胞的3 種相關(guān)酶活性顯著降低。這進(jìn)一步克服了超急性免疫排斥反應(yīng)，使異種器官移植研究得到極大進(jìn)展。堿基編輯工具將為豬異種器官移植提供精準(zhǔn)修飾，避免可能存在的異種移植風(fēng)險，如染色體斷裂或不必要的功能蛋白失調(diào)等。

2.2 白化病模型豬

白化病是機體無法合成黑色素所造成的疾病，分析與白化病相關(guān)的色素突變有助于更好地理解黑色素形成的機制。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶是黑色素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶［50］。人TYR基因的遺傳缺陷可導(dǎo)致眼皮膚白化病1 型（OCA1），這是一種常染色體隱性遺傳病，其特征是頭發(fā)、皮膚和眼睛中的黑色素減少［51］。Li 等［28］用BE3構(gòu)建TYR基因編輯PFFs，通過SCNT 技術(shù)生產(chǎn)TYR基因精準(zhǔn)修飾克隆豬，得到的4 頭白化病模型豬都表現(xiàn)出典型的白化病表型，酪氨酸酶在模型豬的心臟、肝臟、肺或腎臟中不表達(dá)。該疾病模型豬精準(zhǔn)模擬了人類白化病疾病的表征，為白化病治療提供了生物材料。

2.3 瓦登伯革氏綜合征（Waardenburg syndrome,WS）模型豬

WS 是一種顯性的遺傳性聽覺-色素綜合征，以聽力損失和色素沉著減退為特征，患病率約為1/42 000，在我國也發(fā)現(xiàn)散發(fā)病例［52-53］。Hai 等［54］利用N-乙基-N-亞硝基脲誘變技術(shù)建立了WS2A 小型豬模型。其中單等位基因突變（MITFc.740T ＞C 突變）與WS2A 的病理相似，純合突變表現(xiàn)出脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜退化。此模型為更好地理解人類聽力損失的病因和開發(fā)新的治療策略提供新線索。Yao 等［55］以上述MITFc.740T＞C（L247S/ L247S）基因編輯豬模型為基礎(chǔ)，利用HA3A-eBE-Y130F 對突變豬早期胚胎進(jìn)行了校正，基因分型表明，雜合子、純合子胚胎的糾正成功率分別為16.13%、10.87%，可通過產(chǎn)前基因治療實現(xiàn)對該致病性突變的徹底糾正。但hA3AeBE-Y130F 對該豬成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的SNVs脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的HDR 的5 倍，堿基編輯工具仍需要不斷優(yōu)化改進(jìn)。

2.4 杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy,DMD）模型豬

DMD 是一種X 連鎖遺傳性肌營養(yǎng)不良癥，肌營養(yǎng)不良蛋白的缺失損害了肌肉纖維周圍肌膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞膜破裂和滲漏，從而導(dǎo)致肌原纖維壞死，隨后發(fā)生組織纖維化，被脂肪取代并喪失功能［56-58］。小鼠是模擬人類疾病的重要模式動物，但DMD 小鼠模型卻并不表現(xiàn)典型的DMD 癥狀［5］?；谪i與人類的相似性，有望通過豬模擬人類DMD。Xie 等［21］用BE3 結(jié)合SCNT 技術(shù)共構(gòu)建了400 個克隆豬胚胎，并移植到代孕母豬，得到了1 頭健康的DMD單等位基因精準(zhǔn)修飾母豬，有待與WT 公豬交配以產(chǎn)生表現(xiàn)DMD 癥狀的豬。

2.5 免疫缺陷模型豬

研究表明，RAG1或RAG2基因功能缺失的實驗小鼠沒有成熟的B 和T 細(xì)胞［59］，IL2RG在T 細(xì)胞分泌中起重要作用［60］。Xie 等［21］用BE3 結(jié)合SCNT 技術(shù)得到5 頭免疫缺陷癥仔豬，但2 頭RAG1、RAG2、IL2RG多基因編輯仔豬在出生后12、49 d 相繼因肺部感染而死亡，2 頭RAG1、RAG2雙基因精準(zhǔn)修飾仔豬也因相同原因在出生后41、75 d 死亡，只有IL2RG基因精準(zhǔn)修飾仔豬正常生長。與同年齡WT 仔豬相比，多基因編輯仔豬的胸腺小葉萎縮，脾臟小而薄。上述研究成功制備免疫缺陷豬模型，為治療和研究免疫缺陷疾病提供了生物材料。

2.6 人類巨口綜合征（Ablepharon macrostomia syndrome,AMS）模型豬

AMS 和Barber-Say 綜合征（Barber-Say syndrome,BSS）是罕見的先天性外胚層發(fā)育不良，具有相似的臨床特征：無眼瞼、大口、小耳、皮膚松弛、毛發(fā)稀疏、鼻子和耳朵變形，以及乳頭、生殖器、手指和手的各種異常，大部分智力和運動功能發(fā)育正常［61］。雖然AMS 和BSS 是由同一氨基酸Glu 的錯義突變引致，但表型取決于替代的氨基酸。TWIST2 第75 位的賴氨酸導(dǎo)致AMS，而谷氨酰胺或丙氨酸產(chǎn)生BSS［61］。TWIST2基因的1 個堿基改變是導(dǎo)致AMS 的主要原因。Li 等［28］用BE3 構(gòu)建TWIST2基因編輯豬成纖維細(xì)胞，通過SCNT 技術(shù)生產(chǎn)TWIST2基因編輯克隆豬，構(gòu)建AMS 模型豬，該模型豬復(fù)制了人類疾病的表型。

2.7 兒童早衰綜合征（Hutchinson giford progeria syndrome，HGPS）模型豬

HGPS 是一種罕見的散發(fā)性常染色體顯性綜合征，涉及早衰，患者通常在約13 歲時因心肌梗死或中風(fēng)而死亡。大多數(shù)這種綜合征的遺傳基礎(chǔ)是核纖層蛋白 A/C（Lamin A/C，LMNA）基因的第608 位氨基酸對應(yīng)三聯(lián)體密碼子從GGC 變?yōu)镚GT，激活1 個剪接供體位點，產(chǎn)生異常的核纖層蛋白A/C，出現(xiàn)皮膚硬化、關(guān)節(jié)攣縮、關(guān)節(jié)活動范圍縮小、骨骼異常、脫發(fā)、生長障礙、凝血酶原時間延長、血清磷水平升高、低頻傳導(dǎo)性聽力損失和功能性口腔缺損的現(xiàn)象［62］。Xie 等［21］將體外轉(zhuǎn)錄的BE3 mRNA 和LMNA-sgRNA，結(jié)合胚胎注射得到8 頭LMNAG608G 基因精準(zhǔn)修飾仔豬，其中有1 頭C→T 純合突變仔豬，但出生2 d 內(nèi)死亡，經(jīng)耳朵總RNA 的qPCR 試驗和心、肝、脾、肺、腎的Western blot 檢測，LMNAG608G 基因精準(zhǔn)修飾仔豬中存在核纖層蛋白A 突變體（WT仔豬沒有）；進(jìn)一步基因測序發(fā)現(xiàn)，有4 頭仔豬靶點處存在Indels；使用Cas-OFFinder 預(yù)測脫靶位點，選擇7 個風(fēng)險位點分析，8 頭仔豬中有1頭存在脫靶突變，這表明BE3 在生產(chǎn)基因精準(zhǔn)修飾豬中存在安全性問題。

3 堿基編輯技術(shù)在豬遺傳改良中的應(yīng)用

以CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯技術(shù)可以高效地對豬細(xì)胞基因組進(jìn)行改造，將攜帶目標(biāo)基因的改造細(xì)胞作為核供體用于體細(xì)胞克隆，只需1 個世代就能穩(wěn)定獲得1 種或多種優(yōu)良的生產(chǎn)性狀，因此在提高豬生長、肉質(zhì)、繁殖能力和抗病能力上被廣泛應(yīng)用。但脫靶效應(yīng)、基因大片段缺失、染色體結(jié)構(gòu)異常乃至染色體整體缺失等，引發(fā)了學(xué)者對CRISPR/Cas9 有關(guān)生物安全的顧慮［9-11,63］。與CRISPR/Cas9 相比，堿基編輯技術(shù)對基因組的有害切割更小，具有更高的精準(zhǔn)性和生物安全性，因而有望在豬遺傳改良上發(fā)揮更大作用。

3.1 改良豬的生長性狀

豬肉是重要的肉類食品，提高豬的產(chǎn)肉量和瘦肉率是豬遺傳改良的重要目標(biāo)。MSTN基因是介導(dǎo)哺乳動物骨骼肌發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，抑制其表達(dá)可以增加瘦肉率和促進(jìn)肌肉生長［64-66］。早期研究發(fā)現(xiàn)，MSTNSNP 會導(dǎo)致比利時藍(lán)牛產(chǎn)生雙肌臀的表型［67］。由于MSTN 在骨骼肌生長發(fā)育中的特殊功能，MSTN基因成為提高家畜瘦肉率、降低脂肪率、改善肉質(zhì)的基因編輯技術(shù)靶點。已有多個研究團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9 技術(shù)通過敲除MSTN基因以提升豬的產(chǎn)肉性能。2020 年，Li 等［68］和我們研究團(tuán)隊［69］分別得到敲除MSTN的小耳花豬和巴馬小型豬，均表現(xiàn)出肌纖維數(shù)量增加和肌纖維長度減小。基因編輯介導(dǎo)的MSTN敲除能夠顯著提高豬的產(chǎn)肉性狀，提高豬的經(jīng)濟價值，但CRISPR/Cas9 的DSB 可能引發(fā)安全性問題［9-11,63］。為減少安全性問題，減少Indels 的產(chǎn)生，模擬MSTN自然突變過程十分重要。Wang等［70］和我們研究團(tuán)隊［71］在MSTN的PAM 位點對應(yīng)序列設(shè)計sgRNA 進(jìn)行C→T 轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生提前終止密碼子，導(dǎo)致豬成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生MSTN的無義突變。該研究結(jié)果在動物遺傳育種改良中具有很大應(yīng)用潛力，但還需通過構(gòu)建活體基因編輯豬進(jìn)行性能和生物安全驗證。

3.2 提高豬的抗病性能

我國生豬的存欄量約占世界的50%，高傳染性、高致死性豬病不僅會給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，一旦流行甚至?xí)砑Z食安全問題。疫苗的研發(fā)應(yīng)用可使某些傳染性豬病得到一定程度的控制，但由于對野豬群體控制難度大、疫苗具有局限性等，很多豬傳染病難以消滅。豬呼吸與繁殖綜合征是藍(lán)耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引發(fā)的具有較高發(fā)病率和死亡率的傳染病，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最重要的經(jīng)濟疾病之一［72-74］。2014 年起，Whitworth 等［75］針對PRRSV 的受體生產(chǎn)基因敲除豬。Burkard 等［76］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除PRRSV 入侵機體的細(xì)胞受體CD163，成功獲得能夠抵抗PRRSV 感染的基因編輯豬。為了避免安全性問題，減少Indels 的產(chǎn)生和模擬CD163自然突變十分重要。Wang 等［70］在CD163的PAM 位點對應(yīng)序列設(shè)計多個sgRNA 進(jìn)行C→T 轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致豬成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生CD163的無義突變。這項研究為預(yù)防豬病毒性傳染疾病提供了新思路。除藍(lán)耳病外，還存在非洲豬瘟、流行性腹瀉和圓環(huán)病毒病等一系列豬?。?7］。氨基肽酶-N（Aminopeptidase,APN）是一種多功能蛋白，參與多肽代謝、細(xì)胞粘附和冠狀病毒進(jìn)入等多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)，其廣泛存在豬小腸上皮細(xì)胞中［78］。應(yīng)用基因編輯技術(shù)對相關(guān)基因進(jìn)行改良，能有效降低豬的不良性狀和疾病發(fā)生率。

3.3 多性狀聯(lián)合改良

隨著功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，學(xué)者在家畜中鑒定出越來越多有關(guān)經(jīng)濟性狀的SNP。MC4R基因型與許多品系的背部脂肪、生長速率和總體采食量之間存在顯著相關(guān)［79］，MC4Rc.893G ＞A 會導(dǎo)致豬MC4R 功能顯著改變。農(nóng)業(yè)經(jīng)濟性狀主要是由多個SNP 聯(lián)合調(diào)控。開發(fā)高效、精準(zhǔn)的基因組修飾工具，對多個經(jīng)濟性狀基因位點或多個功能基因進(jìn)行同時修飾，對加速豬的遺傳改良十分重要。Wang 等［70］將SpCas9-NG 突變體與hA3A-BE3 融合構(gòu)建hA3A-BE3-NG系統(tǒng)，該融合系統(tǒng)可大大提高可編輯范圍，在高甲基化背景下也能保持一定水平的編輯效率，適用于改良豬的經(jīng)濟性狀。Wang 等［70］在CD163、APN、MSTN和MC4R基因中NG 的PAM 位點對應(yīng)序列設(shè)計sgRNA 進(jìn)行C→T 轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致豬成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生多個經(jīng)濟性狀相關(guān)基因的無義和錯義突變。值得注意的是，由于hA3A-BE3-NG 編輯窗口較寬，旁觀者效應(yīng)（Bystander effect）導(dǎo)致的C→T 較多，且存在一定量的非C→T 突變、脫靶突變和Indels。采用堿基編輯技術(shù)能夠改良豬育種，但目前已經(jīng)確定能夠單一控制性狀的基因少，而且受到PAM 和編輯窗口窄的限制，堿基編輯技術(shù)用于某些特定基因的特定靶點較少。

4 堿基編輯系統(tǒng)在豬成纖維細(xì)胞中的編輯效率和脫靶情況

趙建國研究團(tuán)隊和我們研究團(tuán)隊較關(guān)注堿基編輯系統(tǒng)在豬成纖維細(xì)胞中的編輯效率。鑒于將堿基編輯系統(tǒng)用于豬細(xì)胞的目的是后續(xù)生產(chǎn)基因克隆豬，因此未有在其他細(xì)胞系的相關(guān)試驗。趙建國研究團(tuán)隊用hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F、hA3A-eBE3-Y130F 分別對豬胎兒腎臟成纖維細(xì)胞的IGF2進(jìn)行編輯，堿基編輯效率分別28.57%、23.53%、19.23%，純合突變率分別為16.67%、1.96%、1.92%；Indels 分別為42.86%、31.37%、21.15%，旁側(cè)突變率分別為28.57%、7.84%、9.60%，通過優(yōu)化堿基編輯工具，在維持一定編輯效率的前提下可逐步降低Indels 和旁側(cè)突變率；此外，使用hA3A-BE3-Y130F 對豬胎兒腎臟成纖維細(xì)胞的IGF2進(jìn)行編輯還存在非C→T 突變［80］。該研究團(tuán)隊還用hA3A-BE3-NG 對豬胎兒腎臟成纖維細(xì)胞的APN、CD163、MC4R、MSTN進(jìn)行多基因編輯，結(jié)果顯示，對APN的堿基編輯效率為33.33%，旁側(cè)突變率為35.19%，Indels為9.26%，非C→T突變率為1.85%；對CD163的堿基編輯效率為35.19%，旁側(cè)突變率為12.96%，Indels 為5.56%，非C→T 突變率為9.26%；對MC4R的堿基編輯效率為5.56%，旁側(cè)突變率、Indels、非C→T 突變率均為0%；對MSTN的堿基編輯效率為46.30%，旁側(cè)突變率為18.52%，Indels 為1.85%，非C→T 突變率為11.11%［70］。在堿基編輯效率較高的靶點伴有一定的旁側(cè)突變、Indels 以及非C→T 突變。

我們研究團(tuán)隊改良的PX-YE1-BE4Max-NG 和PX-ABEmaxAW 堿基編輯工具，分別針對C→T 和A→G 轉(zhuǎn)換，前者大多用于提前引入終止密碼子，后者大多用于破壞起始密碼子，引入外顯子跳躍，以及部分點突變引起性狀修復(fù)或損壞。我們使用PX-YE1-BE4Max-NG 對豬胎兒腎臟成纖維細(xì)胞MSTNsite1-5、ApoA5、CD163、LDLR進(jìn)行編輯效率測試，其編輯效率為1%～30.1%［71］；使用PX-ABEmaxAW 對豬胎兒腎臟成纖維細(xì)胞IRX3、MSTN site1-2、DMD進(jìn)行編輯效率測試，其編輯效率為27.4%～49.4%［81］。后續(xù)利用PX-YE1-BE4Max-NG、PX-ABEmaxAW分別對豬胎兒腎臟成纖維細(xì)胞的MSTN、GHR進(jìn)行基因編輯，堿基編輯效率分別為28.6%、33.33%，純合突變率分別為9.5%、33.33%。我們研究團(tuán)隊改良的堿基編輯工具涵蓋了C→T 和A→G 突變，在靶點上保持堿基突變效率的同時無旁側(cè)突變、Indels 以及非C→T 突變，采用CRISPOR（http://crispor.tefor.net）選擇最有可能脫靶的位點進(jìn)行脫靶測試，發(fā)現(xiàn)均無Indels 和潛在堿基突變，后續(xù)可采用更完善的脫靶鑒定方法進(jìn)行檢測。

5 展望

與利用HDR 的CRISPR/Cas9 技術(shù)相比，ABE、CBE 等堿基編輯系統(tǒng)更精準(zhǔn)、更便捷、更高效；與僅能用于功能驗證的轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體相比，ABE、CBE 等在疾病模型構(gòu)建、異體器官移植和精準(zhǔn)遺傳改良方面更符合自然規(guī)則。鑒于豬的生理特性與人非常相似，豬的人類疾病模型對人類臨床前研究非常有價值。研究人員先后培育出免疫缺陷癥、白化病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、兒童早衰癥的堿基編輯疾病模型豬，為疾病發(fā)病機制和治療研究提供了理想的大動物模型。而在農(nóng)業(yè)上，CD163、APN、MSTN和MC4R等靶點堿基編輯豬的成功構(gòu)建，為高效精準(zhǔn)的性狀改良和抗病育種提供了新方案。

目前，在豬精準(zhǔn)修飾中堿基編輯技術(shù)的限制主要體現(xiàn)在以下方面：（1）仍不能確保不產(chǎn)生任何副產(chǎn)物、脫靶突變和Indels；（2）由于受PAM限制，以及編輯活性窗口窄、不同動物不同類型細(xì)胞的編輯活性差異大的限制，堿基編輯技術(shù)仍不能對任意細(xì)胞中的任何位點實現(xiàn)高效編輯，因此仍有許多常見的人類疾病模型難以建立，仍有許多豬優(yōu)良性狀難以通過堿基編輯技術(shù)培育；（3）大動物研究存在生產(chǎn)成本高、養(yǎng)殖和維護(hù)設(shè)施昂貴，以及動物福利等相關(guān)難題；（4）大部分情況下，研究者只能采用導(dǎo)入質(zhì)粒編輯體細(xì)胞+體細(xì)胞核移植的方法，試驗步驟繁瑣。此外，傳統(tǒng)的顯微注射方法具有持續(xù)的Cas9 切割活性，其產(chǎn)生的大部分基因編輯胚胎或動物都存在基因型嵌合。隨著世界各研究團(tuán)隊的深耕，堿基編輯技術(shù)不斷發(fā)展，許多不足正在逐步改善。單堿基編輯技術(shù)的不斷發(fā)展將推動豬精準(zhǔn)修飾在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，推動遺傳病治療、異種器官移植、精準(zhǔn)農(nóng)產(chǎn)品改良快速發(fā)展，造福人類。