SAH 對(duì)豬成纖維細(xì)胞體外增殖及甲基化水平的影響

謝穎瑜，曹嘉程，宋紅兵，王 靜，吳艷玲，肖天放，林瑞意

（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建福州 350002）

豬體細(xì)胞核移植技術(shù)對(duì)豬遺傳改良、種質(zhì)資源保護(hù)及生物醫(yī)學(xué)研究等具有重要意義。然而，豬克隆胚胎發(fā)育效率低下，其主要原因之一是體細(xì)胞核重編程異常，這與表觀遺傳修飾密不可分。DNA 甲基化作為一種常見(jiàn)的表觀遺傳修飾，對(duì)哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。供體細(xì)胞DNA 甲基化狀態(tài)不完全重編程是影響克隆胚胎成功率的主要原因之一，使用高度甲基化的體細(xì)胞作為核供體，會(huì)降低克隆效率。研究發(fā)現(xiàn)，抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的活性是一種有效可行的方法。因此，許多DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTis）被研究并應(yīng)用于降低供體細(xì)胞的DNA 甲基化水平，提高克隆胚胎的成功率，如5-aza-dC、RG108、毛殼素、Zebularine等。S-腺苷高半胱氨酸（SAH）是一種無(wú)毒的DNMTi，研究表明，SAH 處理供體細(xì)胞可降低細(xì)胞的DNA 甲基化水平，提高供體核的重編程效率，促進(jìn)克隆胚胎的早期發(fā)育，但其對(duì)豬供體細(xì)胞的最佳作用濃度與時(shí)間尚不清楚，缺乏SAH 對(duì)豬體細(xì)胞核移植效率的影響研究。本實(shí)驗(yàn)以豬成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，通過(guò)使用不同濃度的SAH 處理豬成纖維細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力、周期、凋亡和甲基化水平等的影響，從而篩選SAH 的最佳作用濃度與時(shí)間，為后期探究SAH 對(duì)豬體細(xì)胞核移植的影響奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用成纖維細(xì)胞分離自官莊花豬保種場(chǎng)4 周齡母豬的耳組織。

1.1.1 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、膠原酶、胰酶、雙抗青鏈霉素、PBS 緩沖液、FBS 胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司）；無(wú)血清凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司）；CCK8 試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司）；DAPI、BSA 封閉液、Triton X-100（北京索萊寶科技有限公司）；多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗體通用稀釋液、Alex Flour488 標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、兔抗人Vimentin 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司）；MethylFlashGlobal DNA Methylation (5-mC) ELISA Easy Kit（武漢艾美捷科技有限公司）；SAH（美國(guó)MedChemexpress 生物科技公司）；總RNA 提取試劑盒（北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司）；Vazyme R223-01 合成試劑盒（南京諾維贊生物技術(shù)有限公司）；HieffTM qPCR SYBRGreen Master Mix（Low Rox Plus）（翊圣生物科技上海有限公司）；DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.2 溶液配制 完全培養(yǎng)液的配制：44 mL DMEM高糖培養(yǎng)基+5 mL FBS 胎牛血清+1 mL 雙抗青鏈霉素；SAH 儲(chǔ)備液的配制：10 mg SAH 粉末+2.6014 mL DMSO，配置成10 mmol/L 的SAH 儲(chǔ)備液，分裝置于-80℃專用冰箱中冷凍保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以0 mmol/L SAH 為對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)包括3 個(gè)部分，第1 部分：分別使用不同濃度的SAH（0、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L）處理豬成纖維細(xì)胞12、24、48、72 h，對(duì)處理后各組的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，篩選SAH 的最佳作用時(shí)間。第2 部分：根據(jù)細(xì)胞活力的檢測(cè)結(jié)果，使用不同濃度的SAH（0、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L）處理豬成纖維細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)、周期、凋亡及DNA 甲基化水平的變化，篩選SAH 的最佳作用濃度；第3 部分：根據(jù)前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以0.1 mmol/L SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h 為實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)qRT-PCR 比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中相關(guān)基因表達(dá)的差異。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 耳組織刮毛清洗干凈后置于無(wú)菌環(huán)境中，使用眼科剪將耳組織剪碎成1 mm大小，轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中，加入2 mL 膠原酶充分混勻，置于搖床中，37℃、220 rpm 消化2～4 h，加入完全培養(yǎng)基終止消化。1 000 rpm 離心3 min，棄上清，加入4 mL 完全培養(yǎng)基吹打混勻，轉(zhuǎn)移至T-25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2 成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%～90%，吸棄原培養(yǎng)液，加入適量PBS 清洗2 次；加入2 mL 胰酶消化1 min 左右，置于倒置顯微鏡（Nikon，TS100）下觀察，若細(xì)胞開(kāi)始回縮變圓，則終止消化并輕輕反復(fù)沖洗瓶底，使細(xì)胞脫落下來(lái)；移入5 mL 離心管中，1 000 rpm 離心3 min，棄上清，加入3 mL 完全培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞，按1:3 的比例進(jìn)行分瓶，后置于CO培養(yǎng)箱（賽默飛，Midi40 CO培養(yǎng)箱）中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 成纖維細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 消化離心步驟同1.2.2，棄上清，加入1 mL 無(wú)血清凍存液吹打重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至2 mL 凍存管后，梯度降溫保存至-80℃冰箱中過(guò)夜后移入液氮罐中。取出凍存管，迅速放入37～39℃恒溫水浴鍋中解凍1～2 min，同時(shí)，輕輕晃動(dòng)凍存管，至凍存液完全融化；將解凍后的細(xì)胞融液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，1 000 rpm 離心3 min；棄上清，加入2 mL完全培養(yǎng)液后輕輕吹打重懸細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸液至T-25培養(yǎng)瓶中；加入3 mL 完全培養(yǎng)液，吹打混勻后放入CO培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)液。

1.2.4 成纖維細(xì)胞純度檢測(cè) 成纖維細(xì)胞屬于間充質(zhì)細(xì)胞，常使用Vimentin 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)成纖維細(xì)胞純度。將第4 代成纖維細(xì)胞鋪至六孔細(xì)胞板（2×10/孔），待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合至70% 左右時(shí)，吸棄原培養(yǎng)基，加入PBS 重復(fù)清洗2 次；每孔中加入1 mL 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定20 min，使用PBS 洗滌細(xì)胞3 次；加入1 mL 0.5% TritonX-100 孵育15 min，PBS 洗滌3次；加1 mL 10%山羊血清室溫封閉2 h，PBST 洗滌2次；加入1 mL 專用型抗體稀釋液稀釋的兔抗人Vimentin 抗體（1:200），室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次；加入1 mL DAPI 復(fù)染5 min，PBST 洗滌3 次后，避光保存，熒光顯微鏡（Nikon，Ts2R-FL 倒置熒光顯微鏡）下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)Vimentin 陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 當(dāng)?shù)? 代成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%～90%進(jìn)行胰酶消化，消化完成的細(xì)胞制成懸液后接種于96 孔板中（100 μL/孔，細(xì)胞數(shù)量約為6 000 個(gè)）；放入CO培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；使用不同濃度的SAH處理供體細(xì)胞；加入10 μL CCK8 溶液，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀（賽默飛，MK3 型酶標(biāo)儀）在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定CCK8 的吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 參照百賽生物細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)樣品制備，24 h 內(nèi)完成流式檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照百賽生物細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)樣品制備，2 h 內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀（BD AccuriC6 Plus 個(gè)人型流式細(xì)胞儀）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 細(xì)胞整體DNA 甲基化水平檢測(cè) ①DNA 的提取：按照DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行DNA 提取，使用NanoDrop分光光度計(jì)（賽默飛NanoDrop分光光度計(jì)）檢測(cè)DNA 純度和濃度；②整體DNA 甲基化水平檢測(cè)：用5-mC ELISA Kit 檢測(cè)各組的DNA整體甲基化水平，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 ng DNA 樣品，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.2.9 細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá) ①細(xì)胞中總RNA 的提?。哼\(yùn)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA 的完整性，并使用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 的濃度和純度；②引物設(shè)計(jì)：采用NCBI 在線軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1；③cDNA 合成：反應(yīng)條件依次為37℃2 min；55℃5 min；85℃5 min，反應(yīng)體系為：RNA Template 5 μL，MonScrip5*RTIII AII-in-One mix 4 μL，MonScriptTMdsDNase 1 μL，Nuclease-Free Water 10 μL；④qRT-PCR 檢測(cè)：反應(yīng)體系為：cDNA 4 μL，HieffqPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，RNase-free ddHO 5.2 μL；反應(yīng)條件為：第1 階段預(yù)變性95℃5 min；第2 階段循環(huán)反應(yīng)95℃10 s 與60℃30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；第3 階段溶解曲線階段使用儀器（Lightcycler 480）默認(rèn)設(shè)置，依照2計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用Modfit LT 進(jìn)行細(xì)胞周期分析，F(xiàn)lowJo_V10 進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析，SPSS 軟件（21.0 版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 8.0.2 進(jìn)行繪圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 豬成纖維細(xì)胞的純度檢測(cè) 成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第4 代時(shí)鋪6 孔板，待生長(zhǎng)匯合至70% 左右，進(jìn)行Vimentin 免疫熒光化學(xué)染色，在熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)Vimentin 陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖1），同時(shí)DAPI 染色計(jì)算總細(xì)胞數(shù)，算出Vimentin 陽(yáng)性細(xì)胞率>95%，說(shuō)明第5 代成纖維細(xì)胞純度較高，可用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 豬成纖維細(xì)胞純度檢測(cè)結(jié)果

2.2 SAH 對(duì)豬成纖維細(xì)胞活力的影響 從不同濃度SAH 處理不同時(shí)間對(duì)豬成纖維細(xì)胞活力的影響可知（圖2），細(xì)胞活力隨著SAH 作用時(shí)間的增加而逐漸降低，作用時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞活力下降愈明顯。12 h，各組的細(xì)胞活力無(wú)顯著差異；24 h，與對(duì)照組相比，0.01 mmol/L及0.1 mmol/L SAH 處理對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，但0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH 處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力極顯著下降；48 h 和72 h，各實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著處理濃度的增加，細(xì)胞活力顯著降低。

圖2 SAH 對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.3 SAH 對(duì)豬成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 從不同濃度SAH 處理成纖維細(xì)胞24 h 對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響可知（圖3），與對(duì)照組相比，0.01 mmol/L 與0.1 mmol/L SAH 處理后細(xì)胞能正常生長(zhǎng)，形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化，但0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH 處理成纖維細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞拉伸變長(zhǎng)，并離壁懸浮，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

圖3 SAH 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.4 SAH 對(duì)豬成纖維細(xì)胞周期的影響 依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA 含量，可將細(xì)胞分為3 個(gè)時(shí)期：G0/G1 期、S 期、G2/M 期，經(jīng)PI 染色后，根據(jù)熒光強(qiáng)度可將處于不同細(xì)胞周期中的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而判斷細(xì)胞所處的周期，結(jié)果如圖4 與圖5 所示?？梢?jiàn)，與對(duì)照組（0 mmol/L）相比，0.1 mmol/L SAH 處理可顯著提高細(xì)胞中G0/G1期的占比；不同濃度SAH 處理后細(xì)胞中G2/M 期的占比均顯著高于對(duì)照組；當(dāng)SAH 作用濃度≥0.1 mmol/L時(shí)，細(xì)胞中S 期的占比顯著低于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，添加濃度為0.1 mmol/L 的SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h可誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G0/G1 期和G2/M 期。

圖4 SAH 對(duì)細(xì)胞周期圖譜的影響

圖5 SAH 對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

2.5 SAH 對(duì)豬成纖維細(xì)胞凋亡的影響 使用不同濃度的SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果如圖6 與圖7 所示?？梢?jiàn)，0.01 mmol/L 和0.1 mmol/L 處理組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率與對(duì)照組（0 mmol/L）相比，均無(wú)顯著變化，但0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH 處理后，細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著提高。

圖6 SAH 對(duì)細(xì)胞凋亡圖譜的影響

圖7 SAH 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.6 SAH 對(duì)豬成纖維細(xì)胞整體DNA 甲基化水平的影響 從不同濃度SAH 處理24 h 后對(duì)豬成纖維細(xì)胞整體DNA 甲基化水平的影響可知（圖8-a），與對(duì)照組相比，SAH 處理可極顯著降低細(xì)胞整體DNA 甲基化水平，SAH 作用濃度越高，下降越明顯。

2.7 SAH 對(duì)成纖維細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響 對(duì)0.1 mmol/L SAH 處理24 h 后的豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)分析可知（圖8-b），與對(duì)照組相比，0.1 mmol/L SAH 處理24 h 可顯著上調(diào)和的表達(dá)，同時(shí)使的表達(dá)極顯著降低，但對(duì)和的表達(dá)無(wú)顯著影響。

圖8 SAH 對(duì)細(xì)胞整體甲基化水平及相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 SAH 處理對(duì)豬成纖維細(xì)胞周期的影響 SAH 是一種非細(xì)胞毒性的DNMTi，在體細(xì)胞核移植前使用SAH 處理供體細(xì)胞可以顯著抑制DNMTs 的活性，促進(jìn)克隆牛胚胎的體外發(fā)育。本研究結(jié)果表明，使用0.1 mmol/L SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h 可將成纖維細(xì)胞阻滯在G0/G1 期，并顯著提高細(xì)胞中基因和基因的相對(duì)表達(dá)量。研究表明，增強(qiáng)和的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在GO/G1 期，而使用或的siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致和表達(dá)下調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1 期阻滯減弱。使用G0/G1 期阻滯的供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植可提高克隆效率，供體細(xì)胞G0/G1 期的染色質(zhì)被認(rèn)為是影響克隆胚胎發(fā)育的最有效因素之一。有報(bào)道稱，供體細(xì)胞周期同步化在G0/G1 期對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要，在克隆胚胎移植到代孕母體后，可以提高其存活率。

3.2 SAH 處理對(duì)豬成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響 細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征，是生物繁育的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，隨著SAH 作用時(shí)間和濃度的增加，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受到抑制，細(xì)胞活力逐漸下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王文璐的研究結(jié)論相似，高濃度的小分子化合物作用于供體細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞DNA 的損傷，激活相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，降低細(xì)胞增殖活力。

凋亡的發(fā)生受促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同調(diào)控，二者比例決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，使用DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體細(xì)胞，可增加細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感度，且DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)供體細(xì)胞凋亡的影響具有累加效應(yīng)。本研究結(jié)果表明，使用0.5 mmol/L 和1 mmol/L SAH處理豬成纖維細(xì)胞24 h 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，但0.1 mmol/L SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h 對(duì)細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因（）表達(dá)無(wú)明顯影響。SAH作為一種DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可降低細(xì)胞中基因的表達(dá)，促使細(xì)胞對(duì)凋亡過(guò)程敏感?；?qū)儆贐CL2 蛋白家族，其編碼的Bcl-xL蛋白被歸類為凋亡抑制劑，通過(guò)阻斷電壓依賴性陰離子通道（VDAC），從而阻止細(xì)胞色素c1 的釋放。

3.3 SAH 處理對(duì)豬成纖維細(xì)胞DNA 甲基化水平的影響 DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳標(biāo)記，與染色質(zhì)的狀態(tài)密切相關(guān)，可抑制基因的活性。SAH 作為一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過(guò)與DNMTs 結(jié)合從而抑制其催化作用，調(diào)節(jié)生物體轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h可降低細(xì)胞整體DNA 甲基化水平和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)。該結(jié)果與Schumann 等人的研究結(jié)果一致，SAH 處理可降低基因的表達(dá)水平。主要以復(fù)制依賴的方式維持體細(xì)胞中的甲基化模式，而和可在DNA 上建立新的甲基化模式。其中，是早期發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵的從頭DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)染色體和基因組結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。有研究表明，體細(xì)胞中的一種特定亞型會(huì)阻礙合子基因組激活和基因組甲基化重編程，導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育停止，而敲除可有效激活胚胎發(fā)育所需基因的表達(dá)，提高克隆效率。

SAH 處理成纖維細(xì)胞可在不影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖和形態(tài)的基礎(chǔ)上，降低DNMT 轉(zhuǎn)錄水平和整體DNA甲基化水平，說(shuō)明SAH 具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞進(jìn)入低分化狀態(tài)、改善克隆效率的潛能。

4 結(jié) 論

0.1mmol/L SAH 處理豬成纖維細(xì)胞24 h 可降低細(xì)胞整體DNA 甲基化水平和DNMT 相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞損傷較小，且可提高細(xì)胞中周期調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯在G0/G1 期，適合用于開(kāi)展后續(xù)的豬體細(xì)胞核移植研究。