基于RNA-seq 篩選白藜蘆醇致豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的可變剪接基因

章會(huì)斌，韓 政，劉陽(yáng)光，周 忍，陳一歌，許黎明，徐啟隆，殷宗俊*，張曉東*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）作為一種非黃酮類多酚化合物，廣泛參與細(xì)胞抗氧化作用，其甲基化類似物在豬卵巢顆粒細(xì)胞（Porcine Ovarian Granulosa Cells，pGCs）中表現(xiàn)出抑制作用，能影響顆粒細(xì)胞雌二醇及黃體酮的產(chǎn)生。此外已有研究證實(shí)RES 能促進(jìn)大鼠卵巢膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡，損傷顆粒細(xì)胞形態(tài)并抑制細(xì)胞增殖。可變剪接（Alternative Splicing，AS）普遍存在于高等生物體內(nèi)，是一種常見(jiàn)的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。通過(guò)剪接基因產(chǎn)生多個(gè)mRNA，從而指導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能的多樣性變化。近年來(lái)，有學(xué)者針對(duì)畜禽基因可變剪接事件的鑒定和生信分析，揭示了可變剪接在動(dòng)物體內(nèi)的重要生理機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，可變剪接可以通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，影響機(jī)體發(fā)育，并參與疾病的發(fā)生。在豬不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織中鑒定到差異可變剪接基因與各時(shí)期的生理狀態(tài)有關(guān)，而北京鴨的皮脂中特有的可變剪接基因參與油脂合成，胸肌中發(fā)生可變剪接的基因與骨骼肌發(fā)育相關(guān)。

課題組前期已有研究指出，RES 可抑制pGCs 增殖，并對(duì)pGCs 凋亡產(chǎn)生影響?；诖?，本研究構(gòu)建了RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡模型，首次通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）及生物信息學(xué)技術(shù)鑒定分析了RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡的可變剪接事件及差異可變剪接基因，有助于在分子水平進(jìn)一步認(rèn)識(shí)pGCs 凋亡的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 測(cè)序樣本的采集與制備 本實(shí)驗(yàn)所用豬卵巢采集自某商業(yè)屠宰場(chǎng)180 日齡的三元雜交豬。豬只屠宰后立即采集、分離卵巢，并保存在37℃含500 IU/mL 青/鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水中。2 h 內(nèi)用保溫瓶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。采用抽吸法收集卵泡液，并分離純化pGCs。將RES 溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，制備0、25、50、75、100 μmol/L RES（RES 購(gòu)自上海麥克林生化科技公司，純度≥99%）的完全培養(yǎng)基。將純化后的pGCs 接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞在培養(yǎng)板內(nèi)增殖到70%～80%的匯合度，更換含有已知濃度RES 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 在細(xì)胞加入RES 后的24 h 和48 h對(duì)pGCs 進(jìn)行凋亡檢測(cè)。參考Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)pGCs 凋亡進(jìn)行檢測(cè)，貼壁pGCs 用胰酶消化收集，用預(yù)冷PBS 洗滌2 次，棄上清。隨后加入5 μL Annexin V-FITC 染液，混勻后避光孵育15 min。再加入10 μL PI 染液混勻，再次孵育5 min 后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)pGCs 的凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 總RNA 的提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 采用TRIzol 法提取pGCs 的總RNA，利用Nanodrop 檢測(cè)RNA 濃度及純度，進(jìn)一步利用Agilent 2100 bioanalyzer 檢測(cè)RNA 完整性。經(jīng)質(zhì)檢合格后委托北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行RNA-seq 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。基于Illumina Hiseq 2500 測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建鏈特異性文庫(kù)。經(jīng)FastQC 軟件質(zhì)控，去除帶接頭的序列（Reads）、低質(zhì)量序列及無(wú)效堿基后，篩選得到純凈序列（Clean Reads）用于后續(xù)分析。使用HISAT2 軟件（v2.1.0）將Clean Reads 與豬參考基因組（v11.1）比對(duì)，以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）作 為標(biāo)準(zhǔn)歸一化各組基因表達(dá)量。本文基于RNA-seq 數(shù)據(jù)鑒定發(fā)生在pGCs 中的可變剪接事件，研究參與pGCs凋亡的可變剪接基因。

1.4 可變剪接事件鑒定 通過(guò)rMATS 軟件（v4.0.2）對(duì)9 個(gè)樣本的可變剪接位點(diǎn)進(jìn)行分析。rMATS 主要識(shí)別外顯子跳躍（Skipping Exon，SE）、內(nèi)含子滯留（Retention Intro，RI）、外顯子互斥（Mutually Excl usive Exons，MXE）、5'端可變剪接（Alternative 5'Splici ng Site，A5SS）、3'端可變剪接（Alternative 3'Splicing Site，A3SS）等5 類可變剪接事件。此外對(duì)值進(jìn)行錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）校正，F(xiàn)DR<0.01 作為判定可變剪接差異顯著性的閾值。

1.5 差異基因的GO 注釋和KEGG 通路分析 使用GOseq R 軟件包對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，利用KOBAS（v2.0）軟件進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes，KEGG）通路富集分析，并基于Edge R 軟件繪制差異可變剪接基因的火山圖。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）檢測(cè) 隨機(jī)挑選6 個(gè)基因（），利用qRT-PCR 檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。使用Primer Premier軟件（v5.0）設(shè)計(jì)引物，以作為內(nèi)參基因，委托上海生物工程股份有限公司合成所需引物（引物序列見(jiàn)表1）。PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL：iTaqUniversal SYBRGreen Super Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（0.1 μg/μL），cDNA 模板1 μL，ddHO 8.2 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，61℃35 s（40 個(gè)循環(huán)）；97℃30 s，65℃90 s，97℃10 s。實(shí)驗(yàn)在Bio-rad CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，采用2法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 軟件（v20.0）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差分析和顯著性檢驗(yàn)使用-test和one-way ANOVA 來(lái)進(jìn)行分析，并在GraphPad 軟件上繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞的影響 如圖1 所示，RES明顯誘導(dǎo)了pGCs 凋亡，并且當(dāng)RES 濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比差異極顯著。因此選取50 μmol/L 作為低濃度誘導(dǎo)凋亡處理組（標(biāo)記為L(zhǎng)），100 μmol/L 為高濃度誘導(dǎo)凋亡處理組（標(biāo)記為H），分別與空白對(duì)照組（標(biāo)記為C）做比較，探討RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡的差異基因表達(dá)。

圖1 不同濃度RES 對(duì)pGCs 的影響

2.2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出與質(zhì)控 pGCs 的9 個(gè)樣本經(jīng)Illumina PE150系統(tǒng)測(cè)序后，平均共產(chǎn)生90 510 724 個(gè)Raw Reads，去除帶adapter 的Reads、含未知堿基的Reads 以及成對(duì)的低質(zhì)量Reads 后，平均每個(gè)樣本篩選到89 216 903 個(gè)Clean Reads（表2）。與豬的參考基因組（v11.1）平均比對(duì)率達(dá)96.04%上，測(cè)序總體錯(cuò)誤率均在0.03%以內(nèi)，其中高質(zhì)量Clean Reads 的Q30 占比在94%以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及比對(duì)結(jié)果

2.3 基因表達(dá)趨勢(shì)分析 對(duì)3 組pGCs 中基因的表達(dá)模式進(jìn)行聚類（<0.001），發(fā)現(xiàn)3 組pGCs 呈現(xiàn)8 種表達(dá)模式（圖2），分為8 個(gè)模塊（分別是Profile 0、1、2、3、4、5、6、7）。有676 個(gè)基因表達(dá)與RES 濃度呈正相關(guān)（Profile 7），329 個(gè)基因表達(dá)量與濃度呈負(fù)相關(guān)（Profile 0），391 個(gè)基因的表達(dá)量在低濃度處理組中存在拐點(diǎn)（Profile 6）。對(duì)Profile 6 中的基因進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路分析（<0.05），發(fā)現(xiàn)Profile 6 中的基因主要富集在細(xì)胞內(nèi)，與DNA 復(fù)制、谷胱甘肽運(yùn)輸、氧化還原酶活性等條目相關(guān)，參與卵巢類固醇生成、甾醇激素合成、谷胱甘肽代謝等信號(hào)通路（圖3）。

圖2 基因表達(dá)趨勢(shì)聚類

圖3 模塊6 中基因的GO 和KEGG 富集

2.4 可變剪接事件鑒定及差異基因篩選 將9 個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與豬參考基因組比對(duì)后，通過(guò)rMATS 軟件對(duì)基因組比對(duì)結(jié)果進(jìn)行可變剪接分析，在低濃度組與對(duì)照組（L vs.C）的比較中，共鑒定出34 186 個(gè)可變剪接事件。在高濃度組與對(duì)照組（H vs.C）的比較中，共鑒定出34 536 個(gè)可變剪接事件（表3）。在不同的可變剪接事件類型中，以SE 類型的可變剪接為主。以<0.05、FDR<0.01 作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，在L vs.C 組中篩選到198 個(gè)基因參與了236 個(gè)可變剪接事件，在H vs.C 組中，有603 個(gè)基因發(fā)生了779 個(gè)可變剪接事件。

表3 可變剪接事件統(tǒng)計(jì)

不同濃度RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡的比較中，SE 類型的可變剪接數(shù)量均最多。在L vs.C、H vs.C 組中，pGCs 發(fā)生SE、RI、MXE 等類型可變剪接事件的比例基本無(wú)明顯變化（圖4），分別為75%、7%、9%，以及78%、8%、7%。在L vs.C 組中，SE 事件有178 個(gè)，在H vs.C 組中，SE 事件則增加到605 個(gè)。A3SS、A5SS類型分別由8%下降到4%，由1%上升到3%。由此可見(jiàn)，參與不同濃度RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡的可變剪接基因具有特異性，可變剪接事件的數(shù)量在不同細(xì)胞狀態(tài)下存在較大差異。

圖4 各類型可變剪接事件的比例

利用DESeq 軟件對(duì)3 組pGCs 的可變剪接基因進(jìn)行差異分析，按照差異表達(dá)倍數(shù)log2|FC|>1、顯著性<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異可變剪接基因，結(jié)果如圖5 所示，L vs.C 組有6 個(gè)差異可變剪接基因（3 個(gè)基因顯著上調(diào)，3 個(gè)基因顯著下調(diào)）。H vs.C 組有35 個(gè)差異可變剪接基因（15 個(gè)基因顯著上調(diào)，20 個(gè)基因顯著下調(diào)）。

圖5 差異可變剪接基因火山圖

2.5 差異可變剪接基因GO 富集分析 為了解發(fā)生可變剪接基因的功能，對(duì)發(fā)生差異可變剪接的基因進(jìn)行了GO 注釋和功能分析。L vs.C 組中6 個(gè)發(fā)生差異可變剪接的基因被富集到208 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）條目、27 個(gè)分子功能（Molecular Function，MF）條目和23 個(gè)細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）條目，推測(cè)發(fā)生差異可變剪接的基因可能廣泛參與生物學(xué)過(guò)程。針對(duì)富集到的結(jié)果，選取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）的10 個(gè)GO 條目，發(fā)現(xiàn)差異可變剪接基因主要富集在谷氨酰胺合成與代謝、氨基酸合成、細(xì)胞凋亡、氧化還原等生物學(xué)過(guò)程（表4）。

表4 L vs.C 組合差異可變剪接基因GO 分析

H vs.C 組中發(fā)生差異可變剪接的基因有35 種，被富集到831 個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目、167 個(gè)分子功能條目和134 個(gè)細(xì)胞組分條目。其中顯著富集的10 個(gè)GO 條目（表5），主要與脂多糖結(jié)合、細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、吞噬小泡中的蛋白質(zhì)加工、低氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路正調(diào)控、吞噬囊泡中蛋白質(zhì)加工的調(diào)控、谷氨酰胺生物合成、磷脂酰膽堿分解代謝等生物過(guò)程相關(guān)，在分子功能上發(fā)揮脂多糖運(yùn)輸功能。

表5 H vs.C 組合差異可變剪接基因GO 分析

2.6 差異可變剪接基因KEGG 通路富集分析 如圖6 所示，L vs.C 組中差異可變剪接基因主要富集于代謝途徑、卵巢類固醇生成、氨基酸生成及代謝等通路。H vs.C 組發(fā)生差異可變剪接的基因被富集到卵巢類固醇生成、-氨基丁酸能突觸、谷氨酸能突觸、精氨酸及葉酸生物合成、維生素消化吸收等通路。

圖6 差異可變剪接基因的KEGG 富集分析

2.7 白藜蘆醇誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡關(guān)鍵可變剪接基因的篩選 基于所篩選2 個(gè)組合的差異可變剪接基因，對(duì)其差異表達(dá)進(jìn)行了分析（圖7），發(fā)現(xiàn)有4 個(gè)基因在L vs.C 及H vs.C 中存在共同表達(dá)，分別是醛酮還原酶家族1 成員C3 基因（Aldo-keto Reductase Family 1 Member C1，）、谷氨酸-氨連接酶基因（Glutamate-Ammonia Ligase，）、肌氨酸脫氫酶基因（Sarcosine Dehydrogenase，）以及MAP 激酶激活死亡結(jié)構(gòu)域基因（MAP Kinase Activating Death Domain，）。結(jié)合上文的GO功能富集和KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)及基因被顯著富集到80 個(gè)GO 條目和20 條KEGG 信號(hào)通路（圖8），廣泛參與了與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及代謝過(guò)程。其中，基因被64 個(gè)GO 條目及13 個(gè)信號(hào)通路富集，表明基因?qū)?xì)胞生命活動(dòng)影響程度更高。以上分析結(jié)果表明這4 個(gè)發(fā)生差異可變剪接的基因，可能在RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡中發(fā)揮作用。

圖7 差異可變剪接基因的維恩圖

圖8 共表達(dá)差異基因富集到GO/KEGG 的數(shù)目

2.8 qRT-PCR 驗(yàn)證測(cè)序可靠性 為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)選擇了6 個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證（圖9）。結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在各組中的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序集中的結(jié)果一致，證實(shí)了測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。

圖9 差異可變剪接基因的qRT-PCR 和RNA-seq 結(jié)果比對(duì)圖

3 討 論

一個(gè)基因可以在mRNA 前體中以不同的剪接方式形成多種mRNA 剪接異構(gòu)體，經(jīng)過(guò)翻譯，最終在蛋白水平層面表現(xiàn)出不同的功能和結(jié)構(gòu)特異性，被認(rèn)為是形成基因組和蛋白組多樣性的一種有效機(jī)制。目前研究表明，基因可通過(guò)可變剪接等調(diào)控機(jī)制，對(duì)細(xì)胞增殖分化、壞死及凋亡等生命過(guò)程產(chǎn)生重要影響。作為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要技術(shù)，RNA-seq 能高效產(chǎn)生基因組序列、準(zhǔn)確定量出基因表達(dá)量，結(jié)合生信分析手段可以實(shí)現(xiàn)在全基因組水平分析各種細(xì)胞不同生理狀態(tài)下的可變剪接事件。

本研究證實(shí)了50 μmol/L 和100 μmol/L RES 極顯著的促進(jìn)了pGCs 凋亡，并通過(guò)RNA-seq 和生信分析，對(duì)RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)和可變剪接進(jìn)行研究，在50 μmol/L RES 處理組發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)差異可變剪接基因，100 μmol/L RES 處理組有35 個(gè)差異基因發(fā)生了可變剪接。此外大多數(shù)發(fā)生可變剪接的基因主要發(fā)生了外顯子跳躍類型的剪接，3'端可變剪接和5'端可變剪接的類型較少，表明可變剪接對(duì)于調(diào)控這些基因的表達(dá)具有重要作用。

通過(guò)對(duì)發(fā)生差異可變剪接的基因進(jìn)行GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因富集在氨基酸合成及代謝、細(xì)胞凋亡、氧化還原及細(xì)胞缺氧反應(yīng)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)加工調(diào)控等與細(xì)胞生命活動(dòng)相關(guān)的GO 條目中，這表明可變剪接通過(guò)調(diào)控差異基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物而在RES 誘導(dǎo)pGCs凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，不同濃度RES 處理pGCs，存在著不同的特異性可變剪接基因，證實(shí)了可變剪接在不同細(xì)胞狀態(tài)下對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及功能起調(diào)控作用。在KEGG 通路富集分析中，差異可變剪接基因主要富集到的信號(hào)通路（卵巢類固醇生成信號(hào)通路、代謝途徑信號(hào)通路的信號(hào)通路、氨基酸代謝相關(guān)信號(hào)通路等）均與激素分泌、細(xì)胞凋亡、有機(jī)物的吸收相關(guān)，這與前人研究一致。研究表明，卵巢類固醇生成信號(hào)通路受損會(huì)抑制哺乳動(dòng)物卵泡排卵、導(dǎo)致顆粒細(xì)胞功能異常，代謝途徑信號(hào)通路廣泛發(fā)生在機(jī)體，參與生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。

為進(jìn)一步篩選可能參與RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡的可變剪接基因，結(jié)合差異可變剪接基因的GO 和KEGG 富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)及基因廣泛參與了細(xì)胞生命活動(dòng)相關(guān)的GO 條目和信號(hào)通路，可能是參與RES 誘導(dǎo)pGCs 凋亡的關(guān)鍵基因。其中，基因家族成員被證實(shí)參與了多囊卵巢綜合征和卵巢腫瘤的發(fā)生，與妊娠晚期卵泡黃體退化相關(guān)?；蚺c谷氨酰胺合成相關(guān)，已有研究指出該基因可以參與細(xì)胞壞死性凋亡進(jìn)程和有絲分裂?；蚩梢耘c基因互作，在腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移及細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而基因可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，與卵巢癌細(xì)胞死亡相關(guān)。前人研究結(jié)果提示，本文所篩選的4 個(gè)差異可變剪接基因均與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)，這些可變剪接基因可能在RES 誘導(dǎo)pGCs凋亡過(guò)程中發(fā)揮特定功能。

4 結(jié) 論

本研究基于RNA-seq 和生物信息學(xué)分析，鑒別并篩選了白藜蘆醇誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)生的差異可變剪接事件，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因發(fā)生了外顯子跳躍形式的可變剪接。通過(guò)GO 和KEGG 分析，進(jìn)一步篩選得到了及等可能參與白藜蘆醇誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的差異可變剪接基因。本研究為豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持，也為進(jìn)一步研究白藜蘆醇對(duì)卵巢發(fā)育的影響提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。