丹系長(zhǎng)白種豬“二胎綜合征”全基因組關(guān)聯(lián)分析研究初報(bào)

崔茂盛，李千軍，張豐霞，江慧青，蘭可心，鄭璐璐，王 敏，孫紅梅，馬 墉*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380；3.天津市柯寶畜牧養(yǎng)殖專業(yè)合作社，天津 300000）

繁殖成績(jī)是豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理的核心，然而受到飼養(yǎng)管理和遺傳等因素的影響，初產(chǎn)母豬較易出現(xiàn)難產(chǎn)、產(chǎn)程長(zhǎng)、產(chǎn)后易感染、乳房發(fā)育不良、二胎窩產(chǎn)仔數(shù)少、斷奶后反復(fù)發(fā)情、奶水不足等等現(xiàn)象，俗稱為“二胎綜合征”。母豬“二胎綜合征”發(fā)生率在飼養(yǎng)管理水平不同的豬場(chǎng)中差異較大。管理水平較高的規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)生率較低，約為10% 左右，而飼養(yǎng)管理水平相對(duì)較差的小養(yǎng)殖場(chǎng)戶，“二胎綜合征”發(fā)生率可達(dá)30%，甚至更高。“二胎綜合征”的出現(xiàn)嚴(yán)重影響母豬繁殖成績(jī)，并造成二胎母豬較高的淘汰率，給豬場(chǎng)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。影響母豬“二胎綜合征”的發(fā)生主要有2 個(gè)方面的原因：在飼養(yǎng)管理上，主要是配種日齡過早、營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備不足、縮短哺乳期、斷奶與配種時(shí)間間隔短等等；在身體發(fā)育方面，個(gè)別母豬發(fā)育緩慢，在配種日齡生殖器官?zèng)]有充分發(fā)育，特別是骨架、骨盆和產(chǎn)道發(fā)育狀態(tài)對(duì)“二胎綜合征”影響較大。本課題組前期對(duì)母豬“二胎綜合征”產(chǎn)生的原因、機(jī)理及防治方法等做了大量文獻(xiàn)調(diào)研，并首次提出科學(xué)的飼養(yǎng)管理雖然能夠降低母豬“二胎綜合征”的發(fā)生率，但并不能徹底解決母豬“二胎綜合征”問題，如果將分子標(biāo)記，特別是將基因組選育（GS）技術(shù)應(yīng)用于“二胎綜合征”母豬的研究，篩選出母豬“二胎綜合征”相關(guān)的SNP 分子標(biāo)記，必將大大提高無“二胎綜合征”母豬選育的精確性，再輔以科學(xué)規(guī)范的飼養(yǎng)管理，有望從根本上解決母豬“二胎綜合征”問題。

在大量文獻(xiàn)調(diào)研及對(duì)母豬“二胎綜合征”充分認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，本團(tuán)隊(duì)于2020 年3—5 月期間對(duì)503 頭250日齡丹系長(zhǎng)白發(fā)情待配后備種豬的胸圍、尻長(zhǎng)和外陰長(zhǎng)寬等體尺性狀進(jìn)行了測(cè)量，并將全基因組測(cè)序信息與體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本課題組在國(guó)內(nèi)外首次利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）技術(shù)，研究母豬“二胎綜合征”和體尺性狀之間的內(nèi)在聯(lián)系，該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討母豬“二胎綜合征”發(fā)生的分子機(jī)理提供了新的研究思路和工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來自天津某大型種豬場(chǎng)的丹系長(zhǎng)白250日齡左右的后備母豬586 頭，體重均在120 kg 以上，母豬體況良好，每頭豬都出現(xiàn)過2～3 次發(fā)情周期。

1.2 表型測(cè)定和方法 在初次配種時(shí)測(cè)定母豬胸圍、尻長(zhǎng)和外陰長(zhǎng)寬等體尺性狀，并采集耳組織樣本進(jìn)行全基因組檢測(cè)分析。體尺性狀測(cè)定方法分別為：

胸圍：在豬肩胛骨后緣部位使用軟皮尺圍繞胸部一圈，松緊度以皮尺自然貼緊毛皮為宜，這一圈皮尺的周長(zhǎng)即為胸圍；

尻長(zhǎng)：使用鋼質(zhì)卷尺測(cè)量從腰角前緣至臀端后緣的平直距離；

外陰長(zhǎng)寬：使用軟皮尺測(cè)量從外陰的上端至下端距離為長(zhǎng)，在外陰長(zhǎng)度的中間位置測(cè)量外陰左右之間的距離為寬。

1.3 母豬“二胎綜合征”發(fā)生率統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)中初次配種母豬數(shù)為586 頭，配種妊娠率為86.5%，即有507 頭母豬妊娠，后來有3 頭流產(chǎn)、1 頭因病淘汰，最終503頭母豬順利產(chǎn)仔。在二胎時(shí)，統(tǒng)計(jì)該503 頭母豬的“二胎綜合征”發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)中，在母豬膘情、環(huán)境條件、飼養(yǎng)管理和配種技術(shù)水平等等相對(duì)一致的條件下，頭胎母豬28 d 斷奶后出現(xiàn)如下任何一種現(xiàn)象即被判斷為“二胎綜合征”：①斷奶后超過10 d 及以上才發(fā)情的母豬；②斷奶后母豬發(fā)情征兆不明顯、靜立狀態(tài)差或?qū)遗洳簧系哪肛i；③二胎時(shí)奶水情況明顯差于第1 胎時(shí)的母豬；④頭胎產(chǎn)仔數(shù)在10 頭以上，而二胎產(chǎn)仔數(shù)小于5 頭的母豬。

1.4 基因組DNA 提取 采用磁珠法提取豬的耳組織基因組DNA，檢測(cè)所有DNA 樣品的濃度和OD 值，保證每份DNA 樣品的濃度均大于50 ng/μL，OD260/OD280為1.7～1.9，樣品DNA 濃度和純度均符合要求。對(duì)基因組DNA 樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，DNA 條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，亮度均一，確?；蚪MDNA 樣品質(zhì)量較好，無蛋白質(zhì)污染，也無降解。

1.5 基因組DNA 分型及質(zhì)控 使用康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司“中芯一號(hào)”50K SNP 芯片對(duì)基因組DNA 進(jìn)行分型，基因分型實(shí)驗(yàn)流程：利用NaOH 溶液對(duì)基因組DNA 進(jìn)行堿變性，恒溫過夜后進(jìn)行基因組全擴(kuò)增，利用酶切將DNA 片段化，然后進(jìn)行DNA 沉淀和重懸，隨后進(jìn)行SNP 芯片雜交及清洗，對(duì)單堿基延伸及染色后掃描芯片，最后通過iScan 掃描系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)。獲得的原始芯片數(shù)據(jù)首先用Beagle 5.0 軟件進(jìn)行基因型的填充，用Plink 1.9 軟件進(jìn)行基因型的質(zhì)控，按照以下質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)篩除不合格的樣本和DNA 位點(diǎn)：只使用常染色體上的位點(diǎn)，最小等位基因頻率大于0.01、哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)的值大于10，檢出率大于90% 的SNP 位點(diǎn)。

1.6 群體結(jié)構(gòu)分析 由于群體分層是造成GWAS 分析假陽性的主要原因，因此采用Plink 1.9 對(duì)SNP 分型數(shù)據(jù)構(gòu)建親緣關(guān)系矩陣（G 矩陣）及主成分分析（PCA），之后采用R 語言的ggplots 和heatmap 函數(shù)繪制熱圖，采用解釋方差最大的前3 個(gè)主成分進(jìn)行散點(diǎn)圖的繪制以及分析群體結(jié)構(gòu)。

1.7 GWAS 分析 本研究使用GEMMA 軟件構(gòu)建混合線性模型進(jìn)行GWAS 分析，模型如下：

其中，為表型向量，X為群體結(jié)構(gòu)效應(yīng)和場(chǎng)、年、季等固定效應(yīng)，Zγ為待檢驗(yàn)標(biāo)記效應(yīng)，～N（0，?）為多基因效應(yīng)，e～N（0，）為殘差效應(yīng)。多基因效應(yīng)中的為標(biāo)記推斷的親緣關(guān)系矩陣。

1.8 候選基因篩選和功能富集分析 本研究根據(jù)GWAS分析得到的顯著的SNP 位點(diǎn)，使用ANNOVAR 軟件將顯著性SNP 位點(diǎn)上下游基因篩選為潛在候選基因，然后使用clusterProfiler 包將注釋到的候選基因根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG 數(shù)據(jù)進(jìn)行基因功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 母豬“二胎綜合征”發(fā)生率 依據(jù)本實(shí)驗(yàn)中母豬“二胎綜合征”判斷標(biāo)準(zhǔn)，503 頭二胎母豬中共有86 頭發(fā)生“二胎綜合征”現(xiàn)象，母豬“二胎綜合征”發(fā)生率為17.1%（86/503）。

2.2 體尺性狀數(shù)據(jù)正態(tài)分布分析結(jié)果 對(duì)所有503 個(gè)樣品進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，胸圍、尻長(zhǎng)和外陰長(zhǎng)寬等體尺性狀的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)都為均值分布，其基本遵循正態(tài)分布規(guī)律。隨后，正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明胸圍、尻長(zhǎng)和外陰尺寸等指標(biāo)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，說明樣品有較好的代表性。

2.3 基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果 本研究經(jīng)質(zhì)控檢測(cè)后剔除的個(gè)體和SNPs 包括：檢出率小于90%的個(gè)體0 個(gè)，位點(diǎn)檢出率小于90%的SNPs 有384 個(gè)，最小等位基因頻率<0.01 的SNPs 有9 831 個(gè)，偏離哈代-溫伯格（<10）的SNPs 有188 個(gè)。最終共有503 個(gè)體和44 495 個(gè)SNPs 用于隨后的關(guān)聯(lián)分析研究。

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析 通過PCA 分析，提取解釋方差最大的前3 位PCA，繪制對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖以反映群體結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1?？梢姡?03 個(gè)樣本絕大多數(shù)個(gè)體聚集在同一區(qū)域，沒有個(gè)體偏離群體，說明本研究中的混合線性模型GWAS 分析較好適用于本研究豬群體。

圖1 群體結(jié)構(gòu)分析

2.5 豬“二胎綜合征”性狀GWAS 分析 由圖2 可知，所有檢驗(yàn)顯著的3 個(gè)SNP 位點(diǎn)信息見表1。GWAS分析結(jié)果顯示，與胸圍顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn)有1 個(gè)（），位于4 號(hào)染色體上的84983220 位置，坐落在NPBWR1 和ST18 基因之間；與尻長(zhǎng)顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn)有2 個(gè)（），其中SNP 位點(diǎn)在10 號(hào)染色體上的6441750 位置，坐落在和基因之間、SNP 位點(diǎn)在12 號(hào)染色體上的43594186 位置，坐落在和基因之間。本實(shí)驗(yàn)中，沒有關(guān)聯(lián)到與外陰尺寸顯著相關(guān)的SNP。

表1 GWAS 分析顯著SNP 位點(diǎn)

圖2 胸圍、尻長(zhǎng)和外陰尺寸等3 個(gè)體尺性狀的GWAS 結(jié)果曼哈頓圖

與胸圍性狀顯著相關(guān)SNP（CNC10041611）相鄰的基因和與尻長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)SNP（）相鄰的、顯著相關(guān)SNP（）相鄰的等3個(gè)基因雖有注釋，但在基因功能富集（GOenrich）中，這3 個(gè)基因功能都沒有被收錄，說明這3 個(gè)基因的功能可能沒有被研究過。

3 討 論

有關(guān)豬“二胎綜合征”產(chǎn)生的原因，國(guó)內(nèi)外研究者已做了大量探討，普遍認(rèn)為“二胎綜合征”的發(fā)生率與飼養(yǎng)管理如配種日齡、營(yíng)養(yǎng)水平和哺乳時(shí)間等因素有關(guān)。但有調(diào)研報(bào)道指出，即使在管理水平較高的大型規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，仍有10%左右的母豬會(huì)發(fā)生“二胎綜合征”。但該報(bào)道同時(shí)也指出，一些母豬生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，特別是骨架、骨盆和產(chǎn)道發(fā)育狀態(tài)對(duì)“二胎綜合征”影響較大。因此本研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)，盡管母豬“二胎綜合征”的發(fā)生率與上述飼養(yǎng)管理水平的高低有關(guān)，但“二胎綜合征”也可能與某些基因的表達(dá)有關(guān)?；诖耍狙芯繄F(tuán)隊(duì)在2020 年3—5 月期間對(duì)586 頭250 日齡丹系長(zhǎng)白后備種豬開展了全基因組檢測(cè)，并測(cè)量了與生長(zhǎng)發(fā)育和生殖道相關(guān)的體尺性狀如尻長(zhǎng)、胸圍和外陰的長(zhǎng)和寬等，利用GWAS 技術(shù)，探討與豬“二胎綜合征”緊密相關(guān)的分子標(biāo)記，為無“二胎綜合征”母豬品種選育提供技術(shù)支撐。

目前GWAS 已廣泛應(yīng)用于候選基因篩選相關(guān)研究，如杜洛克母豬初情期日齡的相關(guān)研究、豬腹股溝/陰囊疝易感基因的篩選、杜洛克豬生長(zhǎng)性狀研究以及不同種豬瘦肉量全基因組關(guān)聯(lián)分析等等。但到目前為止，還未見利用GWAS 技術(shù)探討豬“二胎綜合征”相關(guān)分子標(biāo)記的研究報(bào)道。本研究利用全基因組檢測(cè)技術(shù)對(duì)503 頭250 日齡丹系長(zhǎng)白母豬的胸圍、尻長(zhǎng)和外陰長(zhǎng)寬等體尺性狀開展了GWAS 分析。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，與胸圍體尺性狀顯著相關(guān)的SNP 分子標(biāo)記有1 個(gè)，其相鄰2 個(gè)候選基因分別為和基因。經(jīng)基因功能分析，基因主要與神經(jīng)多肽和G 蛋白偶聯(lián)的多肽等肽類蛋白受體活性顯著相關(guān)；而基因的功能暫未有研究報(bào)道。與尻長(zhǎng)體尺性狀顯著相關(guān)的SNP 分子標(biāo)記有2 個(gè)，其中SNP（）相鄰2 個(gè)候選基因分別為和?；蚬δ芊治鼋Y(jié)果顯示：基因主要參與神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期與細(xì)胞分化等過程；而基因的功能暫未有研究報(bào)道；SNP（）相鄰2 個(gè)候選基因分別為和。經(jīng)功能分析，基因的分子功能主要為糖基化合物或具有糖基鍵化合物的水解酶活性，在細(xì)胞功能活動(dòng)中主要與有性繁殖，如精卵結(jié)合、胚胎和器官組織發(fā)育等顯著相關(guān)。沒有關(guān)聯(lián)到與外陰尺寸顯著相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，這可能與樣本量不夠大有關(guān)，如果進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，是否能夠檢測(cè)到與外陰尺寸顯著相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。但是，從目前課題組得到的豬“二胎綜合征”GWAS 分析結(jié)果來看，和胸圍顯著相關(guān)SNP 相鄰的基因與蛋白代謝緊密相關(guān)、和尻長(zhǎng)顯著相關(guān)SNP 相鄰的基因與神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期等緊密相關(guān)；特別是和尻長(zhǎng)顯著相關(guān)SNP 相鄰的基因與繁殖過程如受精和胎兒組織器官生長(zhǎng)發(fā)育等緊密相關(guān)。目前，本課題組正在開展上述3 個(gè)SNP 分子標(biāo)記的功能驗(yàn)證工作，期望得到與豬“二胎綜合征”緊密相關(guān)的SNP 分子標(biāo)記，為開展無“二胎綜合征”種豬選育提供理論依據(jù)和科學(xué)支撐。

4 結(jié) 論

本團(tuán)隊(duì)將503 頭丹系長(zhǎng)白后備母豬全基因組測(cè)序結(jié)果與胸圍、尻長(zhǎng)和外陰長(zhǎng)寬等體尺性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，篩選到1 個(gè)SNP 與胸圍性狀顯著相關(guān)、2 個(gè)SNP與尻長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)；與該3 個(gè)SNP 相鄰的6 個(gè)基因中，具有功能注釋的基因3 個(gè)，分別和蛋白代謝、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期以及胎兒組織器官生長(zhǎng)發(fā)育等緊密相關(guān)，研究結(jié)果為后續(xù)開展無“二胎綜合征”種豬分子選育奠定了基礎(chǔ)。