幽門螺桿菌陽性胃癌中vacA基因型的分布及其與MEX3A表達的關(guān)系

勾佳鈺，張忠，薄威，梁莉，李佳琦，李曉波，王旭光

（沈陽醫(yī)學院病理學教研室，沈陽 110034）

胃癌是常見的惡性腫瘤，我國胃癌發(fā)病率約占全世界的50%，晚期胃癌的死亡率極高，因此，疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療尤為重要［1］。大量研究表明，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）與胃癌等消化道疾病密切相關(guān)。臨床上約 70%的胃癌患者有H.pylori感染，H.pylori被世界衛(wèi)生組織列為胃癌Ⅰ類致癌因子［2］。H.pylori陽性人群發(fā)生慢性淺表性胃炎、腸化生、異型增生及胃癌的比例高于H.pylori陰性人群［3］。但并非所有慢性淺表性胃炎患者最終都會發(fā)展成胃癌，這與H.pylori菌株特性、患者的易感性以及環(huán)境等因素有關(guān)［4］。

雖然H.pylori菌株均含有細胞空泡毒素基因A（valculating toxin gene A，vacA），但并非所有vacA基因都具有表達活力，這與該基因序列信號區(qū)及中間區(qū)組成情況的多態(tài)性密切相關(guān)。vacA基因存在變異位點信號區(qū)s（s1、s2），負責編碼信號肽的一部分及成熟蛋白的N末端，以及中間區(qū)m（m1、m2），負責編碼部分的P58結(jié)構(gòu)域［5-6］。這些基因變異位點的不同結(jié)合方式（s1m1、s1m2、s2m1、s2m2型）等可使H.pylori的毒力及致病性發(fā)生變化，vacAs1m1和vacAs1m2基因型的毒力更強［7］。本課題組前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，vacA優(yōu)勢基因m1、s1及s1m1亞型與尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）表達呈負相關(guān)，存在以上3種優(yōu)勢基因時，CDX2陽性表達率明顯降低。CDX2是腸上皮特異性轉(zhuǎn)錄因子，主要位于染色體13q12～13，參與維持腸上皮早期分化，是腸上皮分化的早期標志物。研究［4］表明，胃癌組織中CDX2與Reg ⅣmRNA和蛋白的表達呈正相關(guān)，是一種胃腸道的保護因子，在胃癌細胞系A(chǔ)GS及MKN-45中過表達CDX2可抑制癌癥細胞遷移和增殖。

研究表明，秀麗隱桿線蟲肌肉增生蛋白3A（muscle excess 3A，MEX3A）可 與CDX2mRNA 在3’非翻譯區(qū)特定結(jié)合，從而抑制胃癌和結(jié)直腸細胞癌細胞系中CDX2的表達水平；同時，MEX3A過表達還可影響細胞極性，沉默MEX3A可抑制胃癌細胞在G1/M期分裂，并使其集落形成能力下降；MEX3A還參與細胞更新分化、內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、有多元分化能力，在維持腸道干性中有重要作用［9-11］。因此，研究H.pylori陽性患者術(shù)后vacA不同基因亞型與MEX3A表達是否存在相關(guān)性，及vacA具體亞型與MEX3A在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段表達的相關(guān)性，不僅有助于探討疾病機制，還可為早期診斷提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2010年1月至2014年12月沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院外科手術(shù)切除的H.pylori陽性胃癌石蠟包埋組織樣本98例，其中，男76例，女22例，年齡36～87歲。病理診斷均采用雙盲法。本研究獲得沈陽醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測H.pylori基因表達：每個石蠟包埋標本連續(xù)切片10～12 片（厚度4 μm）。按照GT pureTMFFPE試劑盒說明書提取總DNA。利用H.pylori尿素酶基因?qū).pylori基因進行PCR檢測。選用H.pylori vacAs1、m1和m2 特異引物（表1），通過巢式PCR分別對vacAs1、m1和m2 進行擴增。

表1 H.pylori vacA s1、vacA m1、vacA m2基因引物序列Tab.1 Primer sequence of H.pylori vacA s1，vacA m1，vacA m2

1.2.2 免疫組化染色法檢測MEX3A蛋白表達：采用ElivisionTMplus法檢測MEX3A蛋白的表達。將鼠抗人MEX3A多抗（美國Abcam公司，1 ∶400稀釋）滴加于切片，4 ℃孵育過夜。按照Elivision Plus檢測試劑盒（KIT-9901）、即用DAB顯色試劑盒（均購于福州邁新生物技術(shù)公司）說明書，以 PBS 代替一抗作為陰性對照，以陽性表達的胃癌組織作為陽性對照。

免疫組化評分標準：光學顯微鏡下觀察MEX3A免疫組化染色情況，可見其在細胞核、細胞質(zhì)內(nèi)陽性表達。根據(jù)染色程度評分，無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)染色細胞數(shù)評分，陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%～30%為1分，＞30%～50%為2分，＞50%為3分；將染色程度與陽性細胞數(shù)評分相加，0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++），（+）～（+++）為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗與logistics回歸分析H.pylori陽性胃癌中MEX3A及vacA的表達情況及相關(guān)性。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MEX3A表達與臨床病理特征的關(guān)系

本組病例年齡呈偏態(tài)分布，中位年齡60歲，＞60歲60例，≤60歲38例；腫瘤病理分期參照AJCC第八版標準［12］，腫瘤直徑＜5 cm 48例，≥5 cm 50例；中低分化胃癌82例（83.67%），高分化胃癌16例（16.33%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例（73.47%）；按照 Lauren 分型，腸型胃癌59例（60.20%），彌漫型胃癌39例（39.80%）。所有胃癌組織中均有MEX3A表達，且經(jīng)年齡、性別調(diào)整后，MEX3A表達與胃癌腫瘤分化程度相關(guān)，中低分化胃癌組織中MEX3A的表達陽性率高于高分化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見表2。經(jīng)年齡、性別調(diào)整后，MEX3A的表達與腫瘤直徑、TNM分期、浸潤深度、Lauren分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均不相關(guān)（P＞ 0.05）。表明MEX3A有望成為胃癌的標志物，并在中低分化胃癌的疾病進展中發(fā)揮作用 。

表2 MEX3A表達與胃癌患者病理特征Tab.2 Relationship between MEX3A expression and clinicopathological characteristics of patients with gastric cancer

2.2 不同H.pylori vacA基因亞型在胃癌中的分布

PCR結(jié)果顯示，本組98例胃癌組織標本中，vacAs1亞型（65/98，66.30%）表達水平顯著高于其他s亞型，vacAm1亞型（37/98，37.80%）表達水平顯著高于其他m亞型，vacAs1m1亞型（29/98，29.60%）表達水平顯著高于其他聯(lián)合亞型，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）。見表3。

表3 不同H.pylori vacA基因亞型在胃癌中的分布［n（%）］Tab.3 Distribution of different H.pylori vacA gene subtypes in gastric cancer ［n （%）］

2.3 胃癌組織中H.pylori vacA優(yōu)勢基因型與MEX3A表達的關(guān)系

結(jié)果顯示，本組標本中vacAs1、vacAm1及vacAs1m1這3種亞型的表達水平高于其他亞型，對這3種高表達的vacA優(yōu)勢基因型與MEX3A表達之間的關(guān)系行進一步分析，發(fā)現(xiàn)MEX3A的表達與vacAs1亞型密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

表4 H.pylori vacA優(yōu)勢基因型與MEX3A表達間的關(guān)系［n（%）］Tab.4 The relationship between the dominant genotypes of H.pylori vacA and the expression of MEX3A ［n（%）］

3 討論

胃癌具有早期發(fā)現(xiàn)及診斷困難的特點，且發(fā)病后死亡率較高，其發(fā)病機制尚未明確，可能涉及多種分子生物學通路［13］。H.pylori感染與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而幾乎所有的的H.pylori都含有vacA基因，但不同種H.pylori的致病能力不同，推測與vacA基因的不同亞型密切相關(guān)。研究［14］顯示，僅60%有vacA基因表達的H.pylori具有毒力。其中，vacA基因s亞型與黏膜的炎性浸潤有關(guān)，s1m1亞型毒力最強，而s2m2亞型則無毒，目前尚未發(fā)現(xiàn)s2m1亞型菌株，而m亞型與胃黏損傷密切相關(guān)［15］。

本課題組前期研究［8］顯示，vacA優(yōu)勢基因型與CDX2蛋白表達呈負相關(guān)。CDX2是一種腸上皮分子標志物，vacA優(yōu)勢基因m1、s1及s1m1亞型的表達可抑制CDX2表達，且與Ⅲ型胃黏膜腸上皮化生關(guān)系密切。胃黏膜的腸上皮化生通常被認為是一種重要的癌前病變，對胃癌的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。研究［11］表明，通過對胃癌細胞株AGS及結(jié)腸癌細胞系Caco-2全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白MEX3A與尾CDX2mRNA 在3’非翻譯區(qū)存在特定的結(jié)合決定簇，從而抑制胃癌和結(jié)直腸細胞癌細胞系中CDX2的表達水平，同時MEX3A的過表達也可對細胞極性產(chǎn)生影響。

MEX3A是首次發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲的RNA結(jié)合蛋白MEX-3家族成員之一，其N端有2個串聯(lián)的重復異質(zhì)核糖蛋白K同源結(jié)構(gòu)（其中KH域可與微RNA結(jié)合），C端有1個環(huán)指結(jié)構(gòu)域［16］，具有高度保守的特征，該結(jié)構(gòu)域約80%的氨基酸序列相同，可能通過介導特定因子，如RIG形成泛素化的作用，參與促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移。因此，推測MEX3A可能參與胃癌發(fā)生、發(fā)展中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的相關(guān)信號通路，但目前尚未見關(guān)于MEX3A在胃癌組織中表達情況的研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MEX3A表達與不同vacA基因亞型的表達相關(guān)，為了深入了解H.pylori對胃黏膜的毒理作用及致癌機制，本研究對98例H.pylori陽性胃癌組織進行研究后發(fā)現(xiàn)，vacAs1、m1和s1m1的表達水平高于其他亞型，提示在遼寧地區(qū)這3個vacA基因亞型是與胃癌發(fā)展相關(guān)的優(yōu)勢基因亞型，與本課題組前期研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，MEX3A的表達與vacAm1亞型的表達呈正相關(guān)，且其表達水平與腫瘤分化程度有關(guān)。提示vacAm1亞型表達陽性的H.pylori感染可能通過促進MEX3A表達，抑制CDX2胃腸道保護因子，并參與cyclin D1、survivivin、Bcl-2等明星分子調(diào)控，影響胃癌細胞極性，促進胃癌細胞的增殖，影響胃癌凋亡。本研究僅在H.pylori陽性胃癌組織中檢測了MEX3A的表達，仍存在一定的局限性，未來需要通過體外細胞實驗進一步驗證該結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)遼寧地區(qū)H.pylori陽性胃癌患者的癌組織中，vacAm1為優(yōu)勢基因亞型，且其表達與MEX3A相關(guān)，可能通過參與調(diào)控相關(guān)細胞信號通路影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。