溶酶體跨膜蛋白5在卵巢癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

姜曉鳳，蔡鑫澤，張巖，魏力

（中國醫(yī)科大學 1.附屬第四醫(yī)院婦科，沈陽 110032；2.附屬第一醫(yī)院中心實驗室，沈陽 110001）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，死亡率居生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位。滿意的腫瘤細胞減滅術(shù)和術(shù)后以鉑類為基礎(chǔ)的化療是目前主要的治療方式［1-2］。尋找有效的治療靶點是卵巢癌基礎(chǔ)、臨床研究中亟待解決的問題。

溶酶體跨膜蛋白5（lysosomal protein transmembrane 5，LAPTM5），主要定位于晚期溶酶體和核內(nèi)體內(nèi)，在造血組織中呈高表達，其編碼基因位于染色體1p34［3］。研究發(fā)現(xiàn)LAPTM5在T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）和B細胞抗原受體（B cell receptor，BCR）的降解環(huán)節(jié)［4］，自身免疫性疾?。?］、炎癥性腸病［6-7］、腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移等發(fā)面發(fā)揮作用，在卵巢癌中，LAPTM5的表達及其對卵巢癌惡性生物學行為的影響尚不清楚。

腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和耐藥過程中發(fā)揮重要作用［8］。本研究擬探討LAPTM5在卵巢癌細胞中的表達情況，外源性沉默LAPTM5后卵巢癌細胞EMT相關(guān)指標的變化及其對卵巢癌細胞遷移、侵襲能力的影響，旨在為卵巢癌靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人卵巢腺癌細胞株OVCAR3購自美國組織培養(yǎng)庫（American Tissue Culture Colection，ATCC）。宮頸癌細胞株（Hela）和彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株（SUDHL4）購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑：RPMI1640（美國Hyclone公司），F(xiàn)BS（美國Hyclone公司），PBS（美國Hyclone公司），0.25%EDTA胰蛋白酶（美國Gibco公司），DMSO（美國Sigma公司），TRIzol（日本TaKaRa公司），RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公 司），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），APS（美國Sigma-Aldrich公司），TEMED（美 國Sigma-Aldrich公 司），Tween20（北京鼎國生物科技有限公司），BSA（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗人LAPTM5抗體、兔抗人β-actin抗體、鼠抗兔二抗（美國Cell signal公司），ECL發(fā)光試劑盒（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：利用蛋白提取試劑盒分別提取OVCAR3、Hela、SUDHL4細胞總蛋白，定量后行SDS-PAGE分離目的蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉20 min，加入LAPTM5一抗（稀釋比例1 ∶1 000）和 β-actin（稀釋比例1 ∶1 000）4 ℃過夜，加入二抗（1 ∶8 000）室溫孵育1 h，洗膜后天能凝膠成像系統(tǒng)下發(fā)光，拍照。以β-actin為內(nèi)參。采用Image J軟件分析每個樣本蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比，以其比值作為目的蛋白的表達水平。重復實驗3次。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組：6孔板內(nèi)接種OVCAR3細胞（5×105/孔），待細胞生長至70%融合時，按照lipofectamine3000說明書，分別應(yīng)用空對照質(zhì)粒以及LAPTM5沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OVCAR3細胞，記為轉(zhuǎn)染空載體對照組（si-NC）和轉(zhuǎn)染LAPTM5沉默質(zhì)粒組（si-LAPTM5），24～48 h后檢測沉默效率。

1.2.3 RNA的提取和實時定量PCR：應(yīng)用TRIzol 試劑分別提取2組細胞總RNA，加入RNase R降解線狀RNA，RNA樣品稀釋后測定濃度。應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒行實時定量PCR對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增。反應(yīng)條件為預變性95 ℃ 2 min，95 ℃變性15 s，退火60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。測定Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達量。PCR引物序列見表1。重復實驗3次。

表1 相關(guān)引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 細胞劃痕實驗：6孔板背面用直尺劃線，細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用0.25%胰蛋白酶消化制備成細胞懸液，細胞計數(shù)，鋪板（5×105/孔，盡量控制細胞密度隔夜鋪滿板底），次日用100 μL頭垂直劃線，棄去培養(yǎng)基，PBS反復清洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于12 h、24 h倒置顯微鏡觀察、拍照。重復實驗3次。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗：Matrigel膠1 ∶8稀釋，包被Transwell小室。細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化，然后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至5×105/mL。取100 μL細胞懸液加入Transwell小室，24孔板下室加入750 μL含20%血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，棉簽擦去上層未侵襲細胞，PBS清洗3次，在顯微鏡下計數(shù)。重復實驗3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad軟件進行統(tǒng)計學分析，繪制統(tǒng)計圖，數(shù)據(jù)以表示，2組間差異采用獨立樣本t檢驗。采用Photoshop軟件處理圖片。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LAPTM5在人卵巢腺癌細胞OVCAR3中的表達情況

LAPTM5在SUDHL4細胞中呈高表達，在Hela細胞中呈低表達，以這兩種細胞分別作為陽性和陰性對照進行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，與Hela細胞相比，OVCAR3細胞中LAPTM5蛋白表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；與SUDHL4細胞相比，OVCAR3細胞中LAPTM5蛋白表達水平略降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001），見圖1。以上結(jié)果證實，LAPTM5在OVCAR3細胞中表達上調(diào)。

圖1 OVCAR3細胞中LAPTM5蛋白表達情況Fig.1 Expression of LAPTM5 protein in OVCAR3 cells

2.2 沉默LAPTM5抑制人卵巢腺癌細胞OVCAR3細胞遷移

對人卵巢腺癌OVCAR3細胞進行LAPTM5siRNA轉(zhuǎn)染，并利用PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，LAPTM5siRNA能夠有效沉默OVCAR3細胞中LAPTM5的表達（0.139±0.338，P＜ 0.001），見圖2。隨后，通過細胞劃痕實驗檢測LAPTM5對OVCAR3細胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，與對照組（si-NC）相比，實驗組（si-LAPTM5）細胞遷移能力顯著下降（P＜ 0.01）。

圖2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后OVCAR3細胞遷移能力變化Fig.2 Changes in the migration ability of OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

2.3 沉默LAPTM5抑制人卵巢腺癌細胞OVCAR3細胞侵襲

通過Transwell侵襲實驗進一步檢測LAPTM5對OVCAR3細胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與對照組（si-NC）相比，實驗組（si-LAPTM5）細胞侵襲能力下降（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后OVCAR3細胞侵襲能力變化Fig.3 Changes in the invasion ability of OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

2.4 LAPTM5對人卵巢腺癌細胞OVCAR3中EMT相關(guān)標志物mRNA表達水平的影響

實時定量PCR結(jié)果顯示，實驗組（si-LAPTM5）細胞中EMT上皮標志物E-cadherin（3.469±0.618）mRNA表達水平較對照組上調(diào)（P＜ 0.05），間質(zhì)標志物N-cadherin（0.603±0.032）和Vimentin（0.798±0.045）mRNA表達水平下調(diào)（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后OVCAR3細胞EMT相關(guān)指標變化Fig.4 Changes in EMT-related indexes in OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

3 討論

LAPTM5是LAPTM家族的一員，參與蛋白質(zhì)由高爾基體向溶酶體的運輸過程，通過與E3泛素連接酶Nedd4相互作用，影響溶酶體和細胞質(zhì)膜的分選［9-10］。文獻［11-12］報道，LAPTM4β-35在肝細胞癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中高表達，且其表達水平與淋巴結(jié)及遠端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。LAPTM5在食管癌和非小細胞肺癌患者中低表達［13］，有學者認為LAPTM5的失活可能與一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)。Oncomine數(shù)據(jù)庫中，人類膀胱癌組織中LAPTM5基因表達顯著上調(diào)［14］。本研究結(jié)果顯示，LAPTM5在人卵巢腺癌細胞OVCAR3中表達上調(diào)。

EMT過程中E-cadherin表達下調(diào)，N-cadherin、Vimentin等相關(guān)指標表達上調(diào)，細胞極性改變，細胞間黏附減少，失去正常形態(tài)，細胞遷移侵襲能力增強。EMT與卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移以及患者術(shù)后生存率密切相關(guān)［15-16］。本研究結(jié)果顯示，通過外源性沉默LAPTM5基因，人卵巢腺癌細胞OVCAR3細胞遷移、侵襲能力明顯下降，此外沉默LAPTM5會影響OVCAR3細胞EMT相關(guān)指標的變化，導致E-cadherinmRNA表達上調(diào)，N-cadherin、VimentinmRNA表達下調(diào)。CHEN等［14］研究顯示沉默LAPTM5能夠抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，同時發(fā)現(xiàn)LAPTM5的下調(diào)導致E-cadherin的增加和N-cadherin、β-catenin、Slug的減少，與本研究結(jié)果一致。本研究探討了LAPTM5對卵巢癌細胞EMT的影響，提示外源性沉默LAPTM5可能通過抑制卵巢癌細胞EMT進而抑制卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，LAPTM5在人卵巢腺癌細胞OVCAR3中表達上調(diào)，外源性沉默LAPTM5能夠抑制OVCAR3細胞EMT和遷移、侵襲能力。