以β-半乳糖苷酶脂質體為模型篩選冷凍干燥保護劑的新方法

張 寅，王保衛(wèi)，馬婷婷

(石家莊市食品藥品檢驗中心，河北石家莊 050000)

脂質體是一種人工制備的磷脂類生化物質，與細胞膜結構類似，具有典型的雙親分子特性，親水性溶質不能輕易穿過磷脂雙分子層，所以脂質體經(jīng)常被視為理想的人工細胞膜模型。

真空冷凍干燥法由于其包裝、運輸以及保存上獨特的優(yōu)點，而成為一種有效的菌株保藏方法，而且此方法非常適合長期保藏乳制品及食品發(fā)酵劑中的乳酸菌(LAB)。但是如果不添加冷凍干燥保護劑，凍干保藏的細胞很容易失去其自身的活力。研究表明，若直接對乳酸菌進行冷凍干燥，其死亡率將達90%以上。冷凍干燥造成細胞損傷的原因主要包括冰晶形成、鹽濃度升高、活性氧自由基(ROS)增加和細胞膜透性改變等。而細胞膜的損傷則被認為是造成細胞在冷凍干燥過程中死亡的主要原因。對于絕大多數(shù)菌株來說，冷凍干燥保藏法成功的關鍵在于有效保護劑的使用。研究證明，一些多糖和雙糖(如海藻糖和透明質酸)能夠在冷凍干燥時對菌株起到保護作用。凍干保護劑可以改變菌株冷凍干燥時的物理化學環(huán)境，減輕或抑制冷凍干燥或復水對細胞膜的損害，保護蛋白的結構及其生理活性，盡可能保持菌株原有的各種生理生化特性和生物活性。不同的保護劑有著各自的特點，使用單一的保護劑不足以為菌株提供抵抗外界惡劣環(huán)境的條件。因此，在乳酸菌(LAB)的冷凍干燥保存過程中，復配保護劑的使用效果優(yōu)于單一保護劑的使用效果。但是，目前依然采用極其復雜的方法篩選合適的乳酸菌冷凍干燥保護劑，效率極低，耗費了大量的人力物力。該研究首次提出一種可以快速篩選出最優(yōu)冷凍干燥保護劑的方法，以便于在冷凍干燥保藏時有效保存LAB發(fā)酵劑的活性。試驗選取最佳的條件制備脂質體，并以脂質體包埋β-半乳糖苷酶作為細胞膜模型，添加不同的冷凍干燥保護劑，然后對其進行冷凍干燥保存。通過測定β-半乳糖苷酶滲透速度，評價不同冷凍干燥保護劑在凍干條件下對脂質體的保護效果，并選取瑞士乳桿菌9(LH-9)對上述試驗結果進行驗證，從而確定此快速篩選方法的可行性。

1 材料與方法

試劑。鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)、大豆卵磷脂、β-半乳糖苷酶、膽固醇、十八胺，以上試劑均購自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)；海藻糖、透明質酸(HA)、氯仿、Tris溶液、10×磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，以上試劑均購自Fisher Scientific公司(Pittsburgh，PA)；帶Formva膜的40目銅網(wǎng)；牛血清白蛋白、葡聚糖凝膠G-200，均為分析純。

設備。旋轉蒸發(fā)器，R-201，上海申順生物科技有限公司；超聲波清洗器，KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機，JAC-IV型，濟寧市奧波超聲波電氣有限公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀，馬爾文帕納科技公司；TEM-1010透射電子顯微鏡，日本電子公司；自動液相色譜分離層析儀，MC99-3，上海滬西分析儀器廠有限公司；紫外分光光度計，752SPECTROPHOTOMETER，美譜達儀器；真空冷凍干燥儀，F(xiàn)D-1，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；差式掃描量熱儀，DSC821，瑞士梅特勒-托利多集團。

菌株。瑞士乳桿菌菌株(9)，來自中國工業(yè)菌種保藏中心(CICC)。

β-半乳糖苷酶脂質體的制備。卵磷脂和十八胺按10∶1的摩爾比例混合，共計45 μmol，溶于20 mL氯仿中，混合均勻。將混合液體置于50 mL的圓底燒瓶中，并以6 r/min的轉速在37 ℃以下對其進行旋轉蒸發(fā)，直至脂質在瓶壁形成薄膜。然后，在圓底燒瓶中分別加入30 mL氯仿和乙醚，溶解脂質薄膜。在超聲的條件下，加入含有β-半乳糖苷酶(1 290 μg/mL)的磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)20 mL。持續(xù)超聲60 min后，再次對其進行旋轉蒸發(fā)，除去剩余的氯仿和乙醚，直到形成O/W型乳劑，即可得到脂質體。O/W型乳劑通過超聲波細胞粉碎機進行均質處理之后，便會形成粒徑均勻的單層脂質體。

最佳超聲條件。制備少量的單層脂質體，需確定其合適的超聲條件。根據(jù)均質機工作時的超聲時間和超聲功率確定4種制備β-半乳糖苷酶脂質體的超聲處理條件(表1)。

表1 β-半乳糖苷酶脂質體的超聲處理條件

β-半乳糖苷酶脂質體的觀察。用TEM1010透射電子顯微鏡觀察復染的β-半乳糖苷酶脂質體形貌。樣品制備方法：將稀釋3倍的β-半乳糖苷酶脂質體混懸液滴于有Formva膜的400目銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余的液體，滴加2%的磷鎢酸水溶液進行復染色。然后取出銅網(wǎng)，將其正面朝上置于玻璃皿中，室溫下晾干著色。2 min后，用濾紙吸去多余的液體，在透射電子顯微鏡下仔細觀察并照相。

顆粒大小、粒徑分布和Zeta電位的測定。使用ZS90激光粒度儀對β-半乳糖苷酶脂質體的顆粒大小、粒徑分布和Zeta電位進行表征。首先，用蒸餾水稀釋β-半乳糖苷酶脂質體混懸液。然后取2～5 mL樣品，注入固定的比色皿中，放入ZS90激光粒度儀中，在25 ℃條件下進行檢測。經(jīng)過4種不同超聲條件處理過的β-半乳糖苷酶脂質體，需要分別進行檢測。

菌株的培養(yǎng)。使用LH-9驗證β-半乳糖苷酶脂質體模型篩選出的冷凍干燥保護劑對菌株凍干保藏的保護效果。將冷凍干燥的LH-9接種在12%的滅菌脫脂乳中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)至凝乳。取1%的凝乳放入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h。然后將其在6 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min獲取細胞，備用。

LH-9與β-半乳糖苷酶脂質體的冷凍干燥。選取海藻糖、透明質酸以及海藻糖和透明質酸(HA)的復配體系作為菌株的冷凍干燥保護劑，分別與LH-9和β-半乳糖苷酶脂質體混合。凍干保護劑以及它們的濃度如表2所示。所有的樣品都要先在-45 ℃條件下凍存不少于120 min，然后將冷凍的樣品放置于冷凍干燥機中真空凍干20 h。凍干后的樣品(粉末)裝入密封的低溫瓶中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 冷凍干燥保護劑及其濃度

溶解凍干β-半乳糖苷酶脂質體，取脂質體懸浮液1 mL過Sephadex-G200凝膠柱，脂質體純化，收集未包封的β-半乳糖苷酶，采用考馬斯亮藍法，測量其中蛋白質濃度。取1 mL樣品于比色管中，準確加入5 mL的G-250染色液，混合均勻，靜置5 min后于595 nm處測定其吸光度。根據(jù)以下公式計算脂質體中β-半乳糖苷酶的包封率：

對凍干的菌粉進行復溶，15 min后，在6 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，收集菌體。收集的菌體用0.89%的NaCl緩沖液清洗后，再次離心。離心所得菌體沉淀中加入30 mL的緩沖液，然后對菌體細胞進行超聲破碎處理。破碎條件：超聲1 min，間歇0.5 min，共破碎30 min。最后，采用吸光光度法測定懸浮液中β-半乳糖苷酶的酶活力。根據(jù)以下公式計算復溶后瑞士乳桿菌9(LH-9)β-半乳糖苷酶的酶活力保存率：

觀察LH-9凍干時的形態(tài)。將LH-9凍干粉固定于樣品臺上，真空下表面噴金。用透射電子顯微鏡觀察冷凍干燥條件下菌體的形態(tài)特征。

玻璃化溫度的測定。使用DSC821差式掃描量熱儀分別測定添加海藻糖、透明質酸以及復配體系凍干保護劑的LH-9凍干粉的玻璃化溫度。所謂的玻璃化溫度是指無定型聚合物(包括結晶型聚合物中的非結晶部分)由玻璃態(tài)向高彈態(tài)或者由后者向前者的轉變溫度。玻璃化溫度的測定方法：取含有不同保護劑的LH-9凍干菌粉10 mg放入鋁質樣品盤中，以鋁質空盤作為對照，在氮氣環(huán)境下進行掃描。氮氣流量為50 mL/min，掃描的溫度是-20～200 ℃，升溫速率為5 ℃/min。根據(jù)Ozato等的方法計算其玻璃化溫度。

所有試驗重復3次。3個數(shù)據(jù)點用于計算標準偏差，并通過誤差線來表示不確定性。數(shù)據(jù)使用單因素方差分析。均值之間的差異在SPSS軟件中使用duncan檢驗。

2 結果與分析

脂質體的大小是評價脂質體形成最重要的指標。測定的脂質體直徑、分散系數(shù)和Zeta電位如表3所示。已有研究表明，脂質體在形成過程中有聚集的傾向。低濃度時，脂質體聚集趨勢不明顯；隨濃度升高，脂質體聚集趨勢明顯增強，導致更大的聚合體的形成。一般來說，脂質體的平均直徑、分散系數(shù)和Zeta電位越小，脂質體的穩(wěn)定性越好。該試驗中，在條件C(800 W超聲功率，10 min)下脂質體的平均直徑、分散系數(shù)和Zeta電位最小，脂質體的穩(wěn)定性最好。最后，用TEM-1010透射電子顯微鏡觀察包埋β-半乳糖苷酶脂質體在條件C(800 W超聲功率，10 min)下的破碎情況，結果如圖1所示，脂質體呈現(xiàn)為圓形，由TEM照片可估計出脂質體的平均粒徑分布在100～200 nm。

冷凍干燥過程中，非晶相的玻璃化溫度對于長期儲存的微生物活性有至關重要的影響。一般來說，長期處于穩(wěn)定生長狀態(tài)的微生物的玻璃化溫度高于其貯藏期間的玻璃化溫度。利用差示掃描量熱法(DSC)檢測添加不同保護劑凍干菌粉的玻璃化溫度，掃描結果如圖2所示。其中，透明質酸保護劑體系的玻璃化溫度最高，是140 ℃。海藻糖保護體系玻璃化溫度最低，是125 ℃。不同類型的保護劑對凍干菌粉的玻璃化溫度有不同的影響。

表3 不同超聲破碎條件下脂質體懸液的特性

圖1 脂質體投射電鏡照片(×4 000)Fig.1 TEM images of liposome

注：A.海藻糖；B.透明質酸；C.海藻糖和透明質酸的復配體系Note：A.Trehalose；B.Hyaluronic acid；C.Trehalose and hyaluronic acid mixture圖2 冷凍干燥保護劑的玻璃化溫度Fig.2 Glass transition temperature of freeze-drying cryoprotectants

在乳酸菌冷凍保藏過程中，選擇海藻糖和透明質酸作為凍干保護劑來提高凍干菌粉的存活率。凍干保護劑的影響結果如圖3所示，海藻糖濃度是200 mg/mL時，LH-9 β-半乳糖苷酶的酶活保存率最高，為87.7%；脂質體β-半乳糖苷酶的包封率最高，為55.28%。透明質酸濃度是6 mg/mL時，LH-9 β-半乳糖苷酶的酶活保存率最高，為81.36%；脂質體β-半乳糖苷酶的包封率最高，為50.79%。100 mg/mL海藻糖和2.0 mg/mL透明質酸復配使用(復配體系4)時，LH-9 β-半乳糖苷酶的酶活保存率最高，為83.21%；脂質體β-半乳糖苷酶的包封率最高，為55.35%。從圖3可以看出，在達到最大值之前，保存率和包封率都隨著保護劑濃度的增加而升高；最大值之后，隨著保護劑濃度的增加而降低。脂質體包封率和LH-9酶活保存率的統(tǒng)計結果表明，最佳濃度時凍干保護劑的保護效果與空白對照組(0 mg/L)差異顯著。冷凍干燥保護劑的影響結果表明，脂質體包封率和LH-9酶活保存率隨保護劑濃度的升高有相同的變化趨勢。由此可見，利用脂質體模擬細胞膜篩選乳酸菌冷凍干燥保護劑的方法是可行的。

注：不同小寫字母表示Duncan檢驗差異顯著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences in Duncan’s test(P<0.05)圖3 不同濃度海藻糖(A)、透明質酸(B)和復配體系(C)的LH-9 酶活保存率和脂質體β-半乳糖苷酶包封率Fig.3 LH-9 enzyme activity preservation rate and liposomal β-galactosidase encapsulation rate of different concentrations of trehalose(A)，hyaluronic acid(B)and compound system(C)

3 討論與結論

冷凍干燥技術作為有效的菌種保藏手段，在工業(yè)生產(chǎn)上有廣泛的應用。而凍干保護劑的篩選工作作為冷凍干燥保藏技術的關鍵所在，決定著保藏菌株活力的大小。可是，目前所采取的保護劑的篩選方法耗費大量人力物力，阻礙了菌種保藏技術的發(fā)展。該試驗嘗試以β-半乳糖苷酶脂質體的直徑、分散系數(shù)和Zeta電位為檢測指標，聯(lián)合透射電子顯微鏡法，創(chuàng)建一種利用脂質體模擬細胞膜篩選冷凍干燥保護劑的模型，從而快速篩選出瑞士乳桿菌冷凍干燥保護劑，有效提高乳酸菌凍藏菌種的活性。

截至目前，在使用脂質體模擬細胞膜來承載藥物、基因和植物殺蟲劑等方面已經(jīng)進行了大量的研究。但是利用脂質體包埋β-半乳糖苷酶模擬細胞膜來篩選乳酸菌凍干保護劑的相關研究鮮見報道。該試驗以β-半乳糖苷酶脂質體的直徑、分散系數(shù)和Zeta電位為檢測指標，建立并優(yōu)化了脂質體細胞膜模型，結果表明，建立的脂質體細胞膜模型在性質上與真實的細胞膜一樣，而且穩(wěn)定性較高。然后將β-半乳糖苷酶脂質體與凍干保護劑混合凍干，從而以脂質體β-半乳糖苷酶的包封率和瑞士乳桿菌9(LH-9)β-半乳糖苷酶的酶活保存率為指標評價凍干保護劑的保護效果，結果顯示，海藻糖和透明質酸的復配體系作為冷凍干燥保護劑時對凍干菌粉有最佳的保護效果；而且LH-9玻璃化溫度測定所得到的數(shù)據(jù)以及LH-9形態(tài)特征的評價也證明了這一結果。

已有研究表明，冷凍干燥對微生物造成破壞的原因主要有2個：①細胞膜機械損傷；②細胞中敏感蛋白的結構破壞。截至目前，冷凍干燥保護劑在乳酸菌凍干保藏過程的保護機理尚不明確。但是也有研究表明，凍干保護劑之所以可以保護微生物活性，是由于凍干保護劑在微生物冷凍干燥保藏過程起到了“玻璃化”和“水置換”的作用。該試驗關于利用脂質體包埋β-半乳糖苷酶模擬細胞膜篩選凍干保護劑的研究成果，為今后乳酸菌凍干保護劑的篩選研究工作帶來了新的思路。但是這種方法仍然存在許多問題，需要對其進行更加深入細致的研究。