酶促水解制備豬腦抗氧化活性肽

盧文靜 ,陳佳佳 ,諶迪 ,葉沁 ,肖朝耿? ,黃光榮 ,張治國,周天瓊

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所,浙江 杭州 310021;2.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018;3.杭州華津藥業(yè)股份有限公司,浙江 杭州 311241)

豬腦不僅鮮嫩可口、營養(yǎng)豐富,還可以増加機(jī)體的免疫力,是傳統(tǒng)的健腦食品。豬腦含有豐富的蛋白質(zhì),約占新鮮豬腦的10%[1-2]。研究者從動物腦組織中分離蛋白質(zhì),采用酶法水解成游離的氨基酸和低分子水解物,用來治療腦相關(guān)的疾病[3]。豬腦多肽水解產(chǎn)物具有促進(jìn)腦代謝等功效,能夠提高腦組織無氧代謝的ATP 生成量,減少氧自由基生成及類似神經(jīng)生長因子刺激激素生成等[4]。早在20 世紀(jì),我國就已開發(fā)出鎮(zhèn)腦寧等以豬腦為原料的中藥制劑用于治療頭痛。此外,由豬腦制備的腦活素已在臨床上廣泛應(yīng)用40 a,它是75%游離氨基酸和25%短鏈肽的混合物,短肽可能是其生理活性成分[5]。張文治等[6]研究發(fā)現(xiàn),采用乳豬制備的腦活性多肽與價格昂貴的進(jìn)口腦活素發(fā)揮類似作用。豬腦水解物可顯著增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[7],其中水解物的活性短肽可作為類似內(nèi)源神經(jīng)營養(yǎng)因子緩解脊髓型頸椎病[8]。此外,豬腦多肽保護(hù)神經(jīng)元防止大腦損傷,而很多神經(jīng)性疾病的產(chǎn)生與活性氧等自由基相關(guān)[9]。

近年來,抗氧化肽逐漸成為研究熱點。特別是通過生物酶解法制備抗氧化肽,具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程容易控制、對環(huán)境友好和無毒性物質(zhì)產(chǎn)生等優(yōu)點。目前生物酶解法制備抗氧化肽已廣泛應(yīng)用于動植物源抗氧化肽的制備[10-13]。通過酶解制備的生物活性肽不僅具有抗氧化活性,其抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功能也有文獻(xiàn)報道[14-16]。豬腦酶解多肽目前主要被用于治療腦功能障礙疾病,如奧地利生產(chǎn)的腦活素 (Cerebrolyzin)、日本生產(chǎn)的Ceremon 及德國、羅馬尼亞生產(chǎn)的Crelizin 都是通過酶水解腦蛋白水解物獲得的制劑[5]。豬腦酶解物能抑制脂質(zhì)過氧化、降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛的含量,改善β-淀粉樣誘導(dǎo)的小鼠空間記憶力損傷[17]。吳科鋒等[18]采用堿化酶法制備豬腦多肽,發(fā)現(xiàn)多肽分子量主要集中在250～2 000 u,且能減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞毒性作用,降低活性氧生成,對氧化損傷具有保護(hù)作用。雖然已有文獻(xiàn)報道了酶解豬腦多肽抗氧化的活性,但基于抗氧化活性優(yōu)化豬腦多肽制備的研究很少。因此,本文采用食品工業(yè)常用的生物酶,以酶解率為指標(biāo),篩選出豬腦生物酶解適用酶,隨后采用超濾截留不同分子量的多肽,考查酶解液不同組分多肽的總抗氧化活性,以總抗氧化活性為指標(biāo)通過正交法優(yōu)化酶解工藝,以期為豬腦抗氧化肽的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮豬腦 (購自農(nóng)貿(mào)市場);Novozym 37071、Pectinex UF、Celluclast 1.5 L (700 U·g-1)、Flavourzyme 500 MG (500 LAPU·g-1)、Neutrase 0.8 L (0.8 AU·g-1)、Alcalase 2.5 L (2.5 AU·g-1)、Alcalase 2.4 L (2.4 AU·g-1)、Alcalase 3.0 T (3.0 AU·g-1)、Palatase 2 000 L (脂肪酶,20 000 U·g-1) 和Ban 480 L (淀粉酶,480KNU-B·g-1),諾維信 (中國) 生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶 (100 000 U·g-1),南寧龐博生物工程有限公司;胰蛋白酶 (1∶250) 和胃蛋白酶 (1∶30 000),上海源葉生物科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白,生工生物工程 (上海) 股份有限公司;總抗氧化能力試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

5424R 冷凍離心機(jī),德國Eppendorf 公司;Spectra MAX190 全波長酶標(biāo)儀,美國MD 公司;超濾設(shè)備,美國Millipore 公司;pH 計,上海三星儀器有限公司;ULTRA-TURRAX T1.8basic 勻漿機(jī),德國IKA 公司;電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;粉碎機(jī),德清拜杰電器有限公司;烘箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬腦多肽水解酶的篩選

新鮮豬腦自然解凍后,除去血塊和腦膜 (軟腦膜和蛛網(wǎng)膜),用生理鹽水沖洗干凈,均質(zhì)機(jī)勻漿得到豬腦勻漿,密封于冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆肹19]。準(zhǔn)確稱取豬腦勻漿1.00 g,置于250 mL 錐形瓶中,加入200 mL 去離子水,磁力攪拌30 min,根據(jù)表1 進(jìn)行酶解,酶解率計算公式為:酶的水解率=(酶解后水溶性蛋白含量-酶解前水溶性蛋白含量) ×酶解液體積÷豬腦的質(zhì)量×100%。

表1 13 種酶的酶解環(huán)境

1.2.2 豬腦多肽含量測定

豬腦多肽含量測定采用Bradford 法測定并作適當(dāng)修改[20]:取標(biāo)準(zhǔn)品牛血清蛋白制備濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL-1梯度濃度牛血清蛋白溶液,取50 μL 上述標(biāo)準(zhǔn)液于96 孔板中,加入200 μL 考馬斯亮藍(lán)G250,混勻,室溫靜置10 min,檢測595 nm 處吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo),牛血清蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測品的制備:取合適濃度的樣品50 μL于96 孔板中,加入200 μL 考馬斯亮藍(lán)試劑,混勻,靜置10 min,檢測595 nm 處吸光值,根據(jù)回歸方程計算蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 酶解多肽分子量的超濾分離

將酶解液于Millipore 超濾裝置中利用截留量分子依次為5 和1 ku 截留模塊超濾10 min,制備得到3 種分子量范圍多肽,即>5 ku、1～ 5 ku 和<1 ku 的多肽。

1.2.4 酶解多肽抗氧化活性測定方法

不同酶解液的總抗氧化能力測定參考碧云天ABTS 總抗氧化能力試劑盒說明書。將檢測緩沖液、ABTS 溶液和1/1 000 過氧化氫溶液按152∶10∶8 的比例配制新鮮ABTS 工作液;把10 mmol Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液 稀釋成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol。在96 孔板每個檢測孔加入20 μL 過氧化物酶的工作液,空白對照孔中加入10 μL 蒸餾水;標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入10 μL 各種濃度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液;樣品檢測孔內(nèi)加入10 μL 各種待測樣品,混勻后每個孔內(nèi)加入170 μL ABTS 工作液,輕輕混勻后室溫孵育6 min 后酶標(biāo)儀于414 nm處進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的總抗氧化能力?？偪寡趸芰τ嬎愎綖?總抗氧化能力(mmol·g-1)=Trolox 當(dāng)量濃度 (mmol) ÷樣品蛋白濃度 (mg·mL-1) ×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 豬腦抗氧化活性肽提取工藝優(yōu)化

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn),豬腦抗氧化活性肽的酶解工藝受到加酶量、pH、酶解溫度和酶解時間的影響較大。為了優(yōu)化抗氧化活性肽酶解工藝,采用L9 (34) 正交試驗優(yōu)化豬腦抗氧化活性肽提取工藝中胰蛋白酶加入量、pH、酶解溫度以及酶解時間。各因素1、2、3 水平分別為:胰蛋白酶加入量20、25、30 mg;pH 7.0、7.5、8.0;酶解溫度40、45、50 ℃;酶解時間 3、4、5 h。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗結(jié)果通過SPSS 18.0 軟件分析,組間差異比較采用One-way ANOVA 檢驗來比較其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 13 種酶水解率大小關(guān)系

由圖1 可得,對于上述13 種酶,可以發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶的水解率顯著高于其他12 種酶,其次為Ban 480 L;Palatase 2 000 L 的水解率稍高于胰蛋白酶,但二者之間沒有顯著性差異;木瓜蛋白酶、Alcalase 3.0 T、Alcalase 2.4 L 和Neutrase 0.8 L 的水解率之間也沒有顯著性差異,水解率次于胃蛋白酶、Ban 480 L、胰蛋白酶和 Palatase 2 000 L;Novozym 37071、Pectinex UF、Celluclast 1.5 L、Flavourzyme 500 MG 和Alcalase 2.5 L 之間的水解率無顯著性差異,水解率均低于其他酶。對生產(chǎn)常用的13 種酶進(jìn)行篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),豬腦采用一步法酶解制備抗氧化肽的過程中,水解率較高的有胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶。

圖1 13 種酶酶解豬腦蛋白的水解率

2.2 不同分子量酶解物的總抗氧化能力

對胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶4 種酶的酶解液進(jìn)行超濾處理,觀察4 種酶各個組分的抗氧化情況。根據(jù)ABTS 法試劑盒說明書,總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)Trolox 溶液吸光值

總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:以Trolox 濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),求得回歸方程,其中y=-0.678 7x+1.050 8,R2=0.998 5。

4 種酶解液通過截留分子量為5 和1 ku 截留模塊超濾后,沒有發(fā)現(xiàn)分子量>5 ku 的組分,說明4種酶解液水溶性成分的分子量主要分布在5 ku 以下。圖2 可得,除Ban 480 L 外,其他3 種酶中分子量<1 ku 組分的總抗氧化能力顯著高于1～5 ku組分;胰蛋白酶分子量<1 ku 組分的總抗氧化能力顯著高于另外3 種酶。雖然Palatase 2 000 L 的總抗氧化能力稍高于胃蛋白酶,但二者之間無顯著差異。而對Ban 480 L 來說,不論其分子量<1 ku 組分還是1～5 ku 組分,其總抗氧化能力均為最低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),抗氧化活性肽主要集中在分子量<1 ku 的部分,這與Zhang 等[5]發(fā)現(xiàn)低分子量的短鏈豬腦多肽具有顯著的生物活性報導(dǎo)相似。

圖2 4 種酶超濾物的總抗氧化能力

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)因素與水平,以總抗氧化能力為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝。本試驗研究了對豬腦抗氧化活性肽酶解工藝影響較大的4 個因素,即胰蛋白酶的加酶量、pH、酶解溫度、酶解時間。影響酶解工藝的主次因素依次是酶解時間、pH、酶解溫度、加酶量。較優(yōu)水平是酶解時間3 h,pH 為7.0,酶解溫度為40 ℃,加酶量為20 mg,在最適條件下,總抗氧化能力為17.03 mmol·g-1。

3 小結(jié)與討論

本試驗以酶的水解率為指標(biāo),對豬腦蛋白水解工藝所用酶種類進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶4 種酶的酶解率相對較高。針對上述4 種酶的酶解液進(jìn)行超濾處理,發(fā)現(xiàn)酶解液以分子量<1 ku 和1～5 ku 組分為主,且豬腦抗氧化活性肽很可能集中于分子量<1 ku 組分。為了提高豬腦抗氧化活性肽的總抗氧化能力,基于加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH設(shè)計正交試驗,最終得到的較優(yōu)水平為酶解時間3 h,pH 為7.0,酶解溫度為40 ℃,加酶量為20 mg,此時的總抗氧化能力為17.03 mmol·g-1。本試驗可為豬腦多肽的生物活性研究及高值化利用提供參考。