普氏原羚B型諾維氏梭菌的分離鑒定

簡瑩娜，王戈平,李秀萍，吳永林，王光華，林偉山，胡勇，何玉邦，馬利青

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016;2.青海湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，西寧 810001)

普氏原羚(Procapraprzewalskii)是青藏高原地區(qū)的特有瀕危物種，被列為國家Ⅰ級保護(hù)動(dòng)物[1]。我國從20世紀(jì)90年代中期開始，對普氏原羚的生境開展了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)青海湖地區(qū)是目前普氏原羚的唯一分布區(qū)[2]。

本研究中針對一例死亡普氏原羚進(jìn)行病原學(xué)檢測，旨在探討其發(fā)病原因，并提出防治策略。

1 發(fā)病情況

2021年10月16日，青海湖南岸普氏原羚保護(hù)站發(fā)現(xiàn)1只成年普氏原羚不跟群，精神沉郁，行動(dòng)遲緩，隨后臥地不起，最后死亡，由保護(hù)站送檢至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原診斷。

2 剖檢變化

剖檢變化主要表現(xiàn)在胸腔積液，心內(nèi)膜有出血斑，心包積液；肝表面有形狀不規(guī)則、大小不等的壞死灶，呈黃白色，質(zhì)脆；脾輕度腫脹，表面有出血點(diǎn)；肺臟氣腫，體積增大1倍左右；腎腫大，質(zhì)地柔軟；腹腔有積液；腸淋巴腫大，色黑；空腸臌氣，內(nèi)充滿黏性內(nèi)容物；膀胱充盈；氣管環(huán)有淤血；喉頭稍水腫。

3 病原分離鑒定

3.1 涂片鏡檢

取病死普氏原羚各組織進(jìn)行涂片，瑞特氏染色，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)在肝臟組織中存在單個(gè)、散在、兩端鈍圓的大桿菌，詳見圖1。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌接種病死普氏原羚的心、肝、脾、肺、腎和腸淋等臟器組織至普通營養(yǎng)肉湯、鮮血斜面和厭氣肉肝湯(加新鮮生肝)培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)72 h，在接種肝組織的厭氣肉肝湯中，分離得到兩端鈍圓的大桿菌，并有芽孢存在。

4 分子生物鑒定

參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行B型諾維氏梭菌及溶血梭菌特異性引物合成，經(jīng)B型諾維氏梭菌及溶血梭菌雙重 PCR 檢測，結(jié)果在肝臟中檢測到 B 型諾維氏梭菌特異性片段，詳見圖 2。

圖2 B型諾魏氏梭菌及溶血梭菌雙重PCR檢測

(M:DL2000；1-6：分別為心、肝、脾、肺、腎以及腸淋組織DNA；N-：陰性對照；P+：溶血梭菌以及B型諾維氏梭菌混合DNA樣品)

5 小結(jié)

經(jīng)臨床癥狀，剖檢變化，病原菌的分離培養(yǎng)，分子生物學(xué)檢測，確診該普氏原羚是感染了B型諾維氏梭菌而引起的死亡。

6 討論

普氏原羚，別名黃羊、黃灘羊、灘原羚。僅分布于青海湖地區(qū)，為青海湖的旗艦物種。隨著生態(tài)向好，人們保護(hù)意識增強(qiáng)，其種群數(shù)量由保護(hù)初期的300余只增加到目前的2 800余只。普氏原羚的死亡原因較多，其中狼是普氏原羚的主要天敵，其它原因如外傷意外死亡，體內(nèi)外寄生蟲病引發(fā)死亡，機(jī)體嚴(yán)重缺硒及其它營養(yǎng)物質(zhì)短缺而死亡，也存在因種群的性別比例、群體類型、群體大小、捕食風(fēng)險(xiǎn)和人類干擾等因素[4]。同時(shí)，普氏原羚與家畜牛、羊共享一個(gè)草場，使得家養(yǎng)動(dòng)物跟野生動(dòng)物之間也存在動(dòng)物疫病相互傳播的可能性。拉毛彭措等[5]報(bào)道了在海晏縣甘子河地區(qū)死亡普氏原羚可能是梭菌病引起的，但并未進(jìn)行病原學(xué)鑒定。

B型諾維氏梭菌廣泛存在于土壤中，當(dāng)羊采食被此菌芽孢污染的飼草料后，以芽孢形式潛藏于肝組織中，當(dāng)動(dòng)物肝臟受移行期肝片吸蟲的損傷、壞死后，該處的諾維氏梭菌芽胞會(huì)大量繁殖，并產(chǎn)生毒素而進(jìn)入血液循環(huán)，引起毒血癥，導(dǎo)致死亡。因此，本病的發(fā)生經(jīng)常與肝片吸蟲的感染密切相關(guān)[6]。隨著青海湖水位的不斷上漲，救護(hù)中心普氏原羚草場大面積被淹沒，環(huán)青海湖地區(qū)，屬于地下水位高的沼澤地，有利于肝片吸蟲的中間宿主椎實(shí)螺的生長與繁殖。

盡管我們可以用撒生石灰或1∶50 000的硫酸銅殺滅肝片吸蟲幼蟲寄生宿主椎實(shí)螺[7]，但偌大的青海湖濕地如何在保護(hù)青海湖濕地生態(tài)的情況下采取何種方式滅除椎實(shí)螺是擺在我們面前的問題。給野生動(dòng)物注射疫苗和驅(qū)蟲不切實(shí)際，如何保護(hù)野生動(dòng)物免受肝片吸蟲和病菌侵?jǐn)_，又是擺在我們面前的需要探索的課題。

本次從病死普氏原羚的肝臟中檢出了B型諾維氏梭菌，根據(jù)B型諾維氏梭菌病發(fā)病的特點(diǎn)，可基本推斷該普氏原羚在救護(hù)前曾經(jīng)在納灘上生存過，且感染過肝片吸蟲；近幾年我們在環(huán)湖地區(qū)的病死羊中檢出過B型諾維氏梭菌，也證明了環(huán)湖地區(qū)存在B型諾維氏梭菌的污染。

隨著我們對野生動(dòng)物病原研究的積累，在今后研究中將開展病原在家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物間的傳播機(jī)制，其中傳播途徑、機(jī)制以及病原學(xué)研究工作的開展，將會(huì)為今后控制野生動(dòng)物以及家養(yǎng)動(dòng)物相關(guān)疾病的防治策略奠定基礎(chǔ)。