基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州山地野豬冬季盲腸細(xì)菌多樣性分析

彭彩淳 楊雄威 曹和琴 穆 浪 王野影 胡燦實(shí) 張明明 粟海軍*

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽(yáng)，550025；2.貴州大學(xué)生物多樣性與自然保護(hù)研究中心，貴陽(yáng)，550025；3.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025)

腸道微生物菌群是腸道黏膜上的一個(gè)復(fù)雜多樣的生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)于動(dòng)物機(jī)體消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)宿主免疫功能、抵御有害微生物侵害等具有重要意義[1-2]。影響腸道菌群定植的因素有很多，主要包括宿主因素(性別、年齡和免疫系統(tǒng))、環(huán)境因素(水源和食物)和微生物因素等[3]。動(dòng)物腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的器官，還是機(jī)體最大的免疫器官，發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)控、腸道黏膜免疫激活、宿主行為調(diào)控和抵抗病原微生物等重要作用[4]。動(dòng)物盲腸(cecum)的微生物菌群在宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和腸道健康方面也扮演著極為關(guān)鍵的角色，如降解纖維素、半纖維素和不溶性蛋白質(zhì)等為宿主提供能量，還是末端免疫器官發(fā)育和成熟所必需的組成部分[5]。

高通量測(cè)序技術(shù)作為一種全新的技術(shù)手段，能全面地反映樣品微生物的結(jié)構(gòu)與組成[6]，具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)范圍廣、快速和結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，普遍應(yīng)用于細(xì)菌菌群多樣性分析的研究中[7]。近年來(lái)，在家豬[8-13]、野豬(Susscrofa)[14-16]、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)[17]、牛[18]和新疆驢[19]等動(dòng)物腸道微生物的結(jié)構(gòu)及組成、組間共性及獨(dú)有特征和腸道微生物組成[20]等方面的研究中被廣泛應(yīng)用。

野豬系廣泛分布于舊大陸森林、灌木叢中的大型偶蹄類動(dòng)物，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、繁殖迅速、擴(kuò)散能力強(qiáng)和亞種眾多等特點(diǎn)[21]，尤其在缺少天敵的地區(qū)種群增長(zhǎng)迅速。野豬是家豬進(jìn)化和馴化的主要來(lái)源，種群特征在進(jìn)化的同時(shí)可能也會(huì)反映出腸道菌群的進(jìn)化差異[15]。盲腸是消化道中十分特殊的器官，揭示野豬盲腸腸道菌群特征，對(duì)于進(jìn)一步研究野豬生態(tài)適應(yīng)性、生理生化特征等具有重要意義，也可為當(dāng)前十分廣泛和嚴(yán)重的野豬與人沖突的危害管理提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。關(guān)于野豬腸道菌群的研究已有報(bào)道[14]，但揭示其盲腸菌群特征的研究并不多。為此，本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)，分析揭示貴州山地野豬盲腸的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其特性，探究野豬腸道菌群如何與宿主相互作用，為野豬的疾病預(yù)防和免疫發(fā)育研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

由于野生動(dòng)物腸道菌群組成及多樣性可能與生境中的食物資源和地理環(huán)境(山脈、河流和地貌等)密切關(guān)聯(lián)[14，22]，根據(jù)貴州省地形地貌(黔北以喀斯特地貌為主，黔東南以非喀斯特常態(tài)地貌為主)、水系(采樣地涉及貴州省長(zhǎng)江流域和珠江流域)和植被(黔北以喀斯特典型植被為主，黔東南以常綠闊葉林和針葉林為主)等宏觀環(huán)境因素差異(圖1)，于2019年11—12月在貴州省境內(nèi)黔東南、黔北地區(qū)森林環(huán)境中共獵捕12頭健康野豬個(gè)體(表1)，平均體重(72.42±41.62)kg，并依此分組分析。

圖1 野豬個(gè)體捕獲點(diǎn)示意圖

表1 貴州山地野豬個(gè)體信息

1.2 試驗(yàn)方法

按照E.Z.N.A.?試劑盒(OmegaBio-tek，Norcross，GA，USA)說(shuō)明書提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓5 V/cm，20 min)和NanoDrop 2000檢測(cè)DNA的質(zhì)量及DNA濃度和純度。合格的DNA樣品選用細(xì)菌通用引物338F/806R對(duì)16S rRNA基因V3—V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中反應(yīng)參數(shù)和體系參考Quast等[24]的研究。擴(kuò)增后的產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司，USA)對(duì)大小約500 bp的目標(biāo)片段進(jìn)行回收和PCR產(chǎn)物純化，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司，USA)對(duì)回收產(chǎn)物檢測(cè)定量[12]。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司研發(fā)的Miseq PE300系統(tǒng)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序得到的原始序列質(zhì)控和拼接[23]，去冗余、過(guò)濾低豐度序列，去除嵌合體后按97%相似度的分類水平劃分分類單元(operational taxonomic units，OTU)，按最小樣本序列數(shù)抽平后進(jìn)行物種分類學(xué)分析[24]，聚類結(jié)果通過(guò)繪制稀疏曲線反應(yīng)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。其次計(jì)算各樣本的Alpha多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))[25]，采取Wilcoxon秩和檢驗(yàn)檢測(cè)組間差異。PLS-DA分析，即偏最小二乘法判別分析，根據(jù)測(cè)量到的若干值，將檢測(cè)樣本按照類別分組，揭示不同地區(qū)、不同性別個(gè)體盲腸內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異性[26]。通過(guò)LEfSe多級(jí)物種差異判別分析篩選出樣本間的關(guān)鍵差異菌群，使用非參數(shù)因子Kruskal-Wallis(KW)秩和檢驗(yàn)檢測(cè)樣本組間具有顯著豐度差異的細(xì)菌類群，將結(jié)果制成LDA(LDA≥4，P<0.05)可視化柱狀圖[27]。為探討野豬盲腸細(xì)菌菌群在體內(nèi)發(fā)揮的功能，利用PICRUSt軟件標(biāo)準(zhǔn)化后的OTU豐度表與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得相應(yīng)的KEGG orthology(KO)信息，比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)解析到的Pathway level 2功能信息，再通過(guò)SPSS對(duì)2個(gè)地區(qū)、雌雄性別組間的代謝功能進(jìn)行差異分析，本研究選取豐度排名前15的代謝功能類群進(jìn)行可視化[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

從12頭野豬盲腸內(nèi)容物樣本中共獲得原始序列710 949條，堿基總數(shù)為292 930 754，單個(gè)樣本序列為41 628～71 043條，平均每個(gè)樣品的有效序列59 246條，平均長(zhǎng)度412 bp，以97%相似度聚類得到1 256個(gè)OTU。從稀疏曲線可以看出，野豬腸道細(xì)菌群落豐富度(圖2A、C)和多樣性(圖2B、D)已基本飽和，表明增加測(cè)序深度只會(huì)增加少量OTU數(shù)目，而細(xì)菌多樣性不再繼續(xù)增加，測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有細(xì)菌。

圖2 野豬盲腸細(xì)菌觀測(cè)值稀疏曲線

2.2 野豬盲腸細(xì)菌菌群多樣性

2.2.1 不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌菌群Alpha多樣性

通過(guò)對(duì)不同地區(qū)樣本的Shannon指數(shù)(圖3A)分析可知，兩地區(qū)組間細(xì)菌菌群多樣性無(wú)顯著差異(P>0.05)，黔東南地區(qū)部分個(gè)體樣本的細(xì)菌菌群多樣性高于黔北地區(qū)，黔東南地區(qū)的組內(nèi)差異較大。ACE指數(shù)(圖3B)顯示，兩地區(qū)細(xì)菌群落豐富度無(wú)顯著差異，均值相近，但黔東南地區(qū)總體趨勢(shì)低于黔北地區(qū)，部分個(gè)體樣本的豐富度遠(yuǎn)低于組內(nèi)均值，該地區(qū)個(gè)體樣本間離散程度較大。

圖3 不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

2.2.2 不同性別野豬盲腸細(xì)菌菌群Alpha多樣性

針對(duì)雌雄不同個(gè)體樣本的Shannon指數(shù)(圖4A)分析，雄性樣本組盲腸細(xì)菌菌群多樣性顯著高于雌性樣本組(P<0.05)，兩組均值相近。雄性樣本組菌群組成更為復(fù)雜多樣，雌性樣本組內(nèi)差異較為顯著。ACE指數(shù)(圖4B)顯示，雌雄性別間細(xì)菌群落豐富度無(wú)顯著差異，雄性組較雌性組更為豐富。

圖4 不同性別野豬盲腸細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

2.2.3 野豬盲腸細(xì)菌菌群PLS-DA分析

PLS-DA分析表明，黔東南和黔北地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌可以明顯區(qū)分并聚成2個(gè)類群(圖5A)，說(shuō)明兩地區(qū)樣本菌群具有顯著差異(P<0.05)，此外，通過(guò)PLS-DA分布點(diǎn)可以看出兩組內(nèi)均有菌群組成差異較大的個(gè)體樣本；由圖5B可知，雌雄野豬盲腸細(xì)菌可明顯區(qū)分并聚類成2個(gè)類群，雌雄樣本組間差異顯著(P<0.05)，不同雌性個(gè)體樣本菌群組成差異較大。

圖5 野豬盲腸菌群組間PLS-DA分析

2.3 野豬盲腸細(xì)菌菌群組成及結(jié)構(gòu)特征

12頭野豬個(gè)體的盲腸中，共鑒定得到細(xì)菌18門107科278屬464種。總體上，優(yōu)勢(shì)菌門(豐度總值≥95%)為厚壁菌門(Firmicutes，62.37%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，23.63%)、放線菌門(Actinobacteria，5.66%)、變形菌門(Proteobacteria，2.28%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，2.27%)和梭桿菌門(Fusobacteria，2.10%)；優(yōu)勢(shì)菌屬(至少在一組豐度≥1%)主要有Ruminococcaceae_UCG-005(10.36%)、norank_f_Bacteroidales_$24-7_group(7.70%)和Christensenellaceae_R-7_group(6.27%)等16個(gè)。

2.3.1 不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌菌群組成及相對(duì)豐度

厚壁菌門為兩地區(qū)中最大優(yōu)勢(shì)菌群門類(QB 65.91%，QDN 59.84%)(圖6A)；第2豐度菌群為擬桿菌門(QB 14.52%，QDN 29.68%)，黔東南地區(qū)擬桿菌門較黔北地區(qū)豐富，菌群富集程度更高；再則為放線菌門(QB 11.85%，QDN 1.24%)，兩組放線菌門的豐度存在顯著差異(P<0.05)。菌群中豐度≤0.01%的纖維桿菌門(Fibrobacteres)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和Saccharibacteria菌群僅在黔東南地區(qū)的野豬盲腸中有少量分布，在黔北地區(qū)的野豬盲腸中尚未檢測(cè)到；衣原體門(Chlamydiae，0.53%)及豐度≤0.01%的酸桿菌門(Acidobacteria)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)和儉菌總門(Parcubacteria)的菌群僅在黔北地區(qū)的野豬盲腸中有少量分布，在黔東南地區(qū)的野豬盲腸中尚未發(fā)現(xiàn)。

在屬水平上，圖6B展示了兩地區(qū)的主要優(yōu)勢(shì)菌群，共16個(gè)屬(QB 64.67%，QDN 65.09%)。黔北地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌豐度最高的3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬分別是Ruminococcaceae_UCG-005(11.69%)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium，9.49%)和Christensenellaceae_R-7_group(8.43%)；黔東南地區(qū)豐度最高的3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬分別是norank_f_Bacteroidales_$24-7_group(10.74%)、Ruminococcaceae_UCG-005(9.40%)和擬普雷沃菌屬(Alloprevotella，6.50%)。黔北地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌群之一的雙歧桿菌屬在黔東南地區(qū)的相對(duì)豐度僅有0.12%；擬普雷沃菌屬在黔東南地區(qū)屬于優(yōu)勢(shì)菌群之一，但在黔北地區(qū)豐度僅有0.33%，其他屬細(xì)菌在兩地區(qū)的豐度也有所不同，說(shuō)明兩地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖6 不同地區(qū)野豬盲腸菌群組成及相對(duì)豐度

2.3.2 不同性別野豬盲腸細(xì)菌菌群組成及相對(duì)豐度

圖7 不同性別野豬盲腸菌群組成及相對(duì)豐度

2.4 野豬盲腸細(xì)菌菌群差異

2.4.1 不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌菌群差異

基于門水平至屬水平的相對(duì)豐度矩陣對(duì)兩地區(qū)分別進(jìn)行LEfSe分析(圖8)發(fā)現(xiàn)，黔北地區(qū)的放線菌門、軟壁菌門(Tenericutes)和unclassified_k_norank的豐度顯著高于(P<0.05)黔東南地區(qū)。黔北地區(qū)菌屬豐度顯著高于(P<0.05)黔東南地區(qū)的有雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和乳桿菌屬等11個(gè)；黔東南地區(qū)菌屬顯著高于(P<0.05)黔北地區(qū)的有擬普雷沃菌屬、Terrisporobacter、顫桿菌克屬(Oscillibacter)和顫螺旋菌屬(Oscillospira)等6個(gè)。

圖8 不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌多樣性門水平至屬水平的LDA判別

2.4.2 不同性別野豬腸道細(xì)菌菌群差異

在性別差異分析上(圖9)，雄性樣本厭氧原體屬(Anaeroplasma)顯著高于雌性(P<0.05)；雌性樣本Tyzzerella、房間芽胞桿菌屬(Domibacillus)和氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)等6個(gè)菌屬豐度顯著高于雄性(P<0.05)。

圖9 不同性別野豬盲腸細(xì)菌多樣性門水平至屬水平的LDA判別

2.5 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

PICRUSt基因預(yù)測(cè)表明，樣本體內(nèi)檢測(cè)出的所有細(xì)菌基因主要調(diào)控野豬個(gè)體盲腸樣本富集的44條代謝途徑，圖10、圖11分別展示了兩地區(qū)、雌雄樣本組間相對(duì)豐度>2%的15條代謝途徑。

2.5.1 不同地區(qū)野豬盲腸PICRUSt功能預(yù)測(cè)

總體上看(圖10)，兩地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌均以新陳代謝途徑為主(QDN 57.91%，QB 57.35%)，兩地區(qū)樣本代謝途徑中相對(duì)豐富度最高的均為碳水化合物代謝途徑(QDN 16.44%，QB 16.23%)的功能基因，其次依次為氨基酸代謝途徑、輔助因子和維生素代謝、能量代謝等途徑的功能基因。由此說(shuō)明兩地區(qū)個(gè)體盲腸細(xì)菌功能基因豐富度差異不顯著，基本相同，功能性高度相似。

圖10 不同地區(qū)野豬盲腸PICRUSt基因預(yù)測(cè)聚類熱圖

2.5.2 不同性別野豬盲腸PICRUSt功能預(yù)測(cè)

不同性別組間功能性細(xì)菌基因代謝途徑的差異不顯著(圖11)，雌雄樣本均以新陳代謝途徑的功能基因?yàn)橹?，其中雄?7.84%，雌性57.35%，代謝途徑中均以碳水化合物代謝途徑為主，其次依次為氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝等途徑。

圖11 不同性別野豬盲腸PICRUSt基因預(yù)測(cè)聚類熱圖

2.5.3 野豬盲腸PICRUSt功能差異

經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)可知(圖12)，不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌的循環(huán)系統(tǒng)(circulatory system，圖12A)和寄生蟲傳染病(infectious disease parasitic，圖12B)途徑存在顯著差異(P<0.05)，雌雄性別間膜運(yùn)輸途徑(membrane transport，圖12C)存在顯著差異(P<0.05)，其他代謝途徑存在一定的異同。

圖12 野豬盲腸PICRUSt預(yù)測(cè)基因代謝途徑差異

3 討論

3.1 野豬盲腸細(xì)菌菌群多樣性

近年來(lái)，利用高通量Illumina測(cè)序可檢測(cè)不可人工培養(yǎng)的腸道細(xì)菌，測(cè)序快速且結(jié)果準(zhǔn)確度高，可全面反映復(fù)雜樣品的微生物群落的組成，是目前微生物多樣性研究的重要技術(shù)手段之一[29]。本研究通過(guò)高通量技術(shù)檢測(cè)貴州野豬盲腸，聚類分析共得到研究區(qū)域野豬盲腸細(xì)菌隸屬18門278屬，其菌群多樣性和豐富度均顯著高于西藏高原藏豬盲腸(13門56屬)[11]和重慶圈養(yǎng)野豬(13門118屬)[16]，略高于河南省滎陽(yáng)野豬腸道菌群(17門163屬)[15]，這可能是由于食物來(lái)源[22]、棲息環(huán)境的不同而導(dǎo)致菌群多樣性的不同。研究結(jié)果略低于貴州苗嶺地區(qū)野豬腸道細(xì)菌菌群(19門292屬)[14]，說(shuō)明貴州地區(qū)野豬盲腸富含了野豬腸道的大部分細(xì)菌菌群(門占94.74%，屬占95.21%)，僅有少量種類未富集。Alpha多樣性分析顯示兩地區(qū)及雌雄組間差異不大，可能是因相同(臨近)地域的樣本食物[22]、棲息環(huán)境相似導(dǎo)致腸道菌群差異不顯著；各樣本菌群組成結(jié)構(gòu)存在一定差異，可能作為機(jī)會(huì)主義雜食動(dòng)物的野豬[30]進(jìn)食有所不同而導(dǎo)致各自腸道菌群不同。

3.2 不同地區(qū)野豬盲腸細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其差異

從菌群結(jié)構(gòu)看，野豬盲腸細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門依次為厚壁菌門(62.81%)、擬桿菌門(23.63%)、放線菌門(5.96%)、變形菌門(2.26%)、疣微菌門(1.72%)和梭桿菌門(1.57%)，與前人研究的豬腸道中豐富度最高的菌門為厚壁菌門和擬桿菌門[31]的結(jié)論相同。貴州苗嶺地區(qū)野豬其他腸段(胃、結(jié)腸和直腸)中也以厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群[14]，這一觀點(diǎn)在西藏高原藏豬[11]、中國(guó)特有的丫杈豬、青裕豬和烏金豬[32]及其他家豬研究中[33-35]也得到了證實(shí)，這表明厚壁菌門和擬桿菌門的富集對(duì)食草和雜食性動(dòng)物具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門與擬桿菌門的相對(duì)比例能夠反映宿主對(duì)能量吸收和儲(chǔ)藏的能力[36]，從而能在一定程度上決定機(jī)體的肥瘦情況。作為野豬盲腸主要優(yōu)勢(shì)菌門之一的厚壁菌門最主要的功能是降解纖維類物質(zhì)，將纖維素分解成宿主可利用的揮發(fā)性脂肪酸，提高宿主的營(yíng)養(yǎng)利用率，還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞提高宿主免疫能力，預(yù)防腸道炎癥，維持腸道微生物生態(tài)平衡[37]；而擬桿菌門主要降解非纖維類物質(zhì)[38-39]，尤其在降解和吸收多糖、碳水化合物和蛋白質(zhì)等物質(zhì)方面具有關(guān)鍵作用[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)放線菌門、變形菌門與河南省滎陽(yáng)縣研究的野豬盲腸菌群豐富度(放線菌門為31.22%～46.66%，變形菌門為0.29%～32.39%)[15]差異較大，這可能是放線菌門和變形菌門的菌群是主要的纖維素降解菌，而研究區(qū)野豬主要降解纖維素的后壁菌門豐度較高，且野外自然生存和圈養(yǎng)環(huán)境不同，導(dǎo)致兩地野豬的放線菌門和變形菌門菌群不同。放線菌門種類在動(dòng)物腸道中占有一定的優(yōu)勢(shì)地位，它們可以產(chǎn)生對(duì)宿主健康和體內(nèi)平衡至關(guān)重要的關(guān)鍵抗生素、免疫調(diào)節(jié)化合物和代謝物[40]，放線菌作為抗菌藥物的抗性促進(jìn)劑作用得到了充分的證明[15]，這與野外生存的野豬具有較強(qiáng)的抗病和免疫能力、無(wú)需人工進(jìn)行免疫防治的情況相符合。因此，對(duì)于在野外自然生長(zhǎng)、以粗纖維為主要食物的野豬來(lái)說(shuō)，在食物的降解、吸收和抗菌免疫等方面，厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門等主要核心菌群起著至關(guān)重要的作用。

在屬水平上，Ruminococcaceae_UCG-005是盲腸中豐度最高的菌屬，在以往研究中表明，瘤胃球菌科中許多菌屬能夠產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶等碳水化合物降解酶，有助于細(xì)胞吸收糖分和利于食物消化[41]。瘤胃球菌科真桿菌屬(Eubacterium)含有多種能降解淀粉的基因，能夠分解多糖產(chǎn)生丁酸等短鏈脂肪酸[42]，因此Ruminococcaceae_UCG-005和Ruminococcaceae_UCG-014在動(dòng)物腸道中應(yīng)該也具有降解纖維素的功能。毛螺菌科(Lachnospiraceae)多個(gè)屬[43]、Christensenellaceae_R-7_group[11]和瘤胃球菌屬[44]等菌屬參與纖維素的降解，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體及腸道微生物提供能量。擬桿菌門的擬普雷沃菌屬、擬桿菌屬(Bacteroides)和Prevotellaceae_NK3B31_group等菌群在促進(jìn)動(dòng)物降解不易消化的食物、吸收食物養(yǎng)分及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面具有重要作用[10，45]。雙歧桿菌屬菌群屬于典型的益生菌，雙歧桿菌體內(nèi)含有大量的消化酶能消化一些機(jī)體內(nèi)不能依靠本身酶系消化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)個(gè)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時(shí)還能增強(qiáng)免疫力和抗癌能力[46]，具有降血脂[46]和護(hù)肝等功能[47]，多種菌屬的共同協(xié)作才能提升野豬應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 不同性別野豬盲腸細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及差異

雌雄樣本組間顯著差異的菌群為軟壁菌門厭氧原體科(Anaeroplasmataceae)的厭氧原體屬和氨基酸球菌屬、厚壁菌門毛螺菌科和變形菌門Roseiarcus。研究區(qū)域雌性野豬盲腸厚壁菌門豐度(64.11%)顯著高于Wang等[12](53.65%)和Yang等[15](30.45%～52.35%)的研究結(jié)果，擬桿菌門(24.45%)則顯著低于Wang等[12](38.22%)的研究結(jié)果，高于Yang等[15](0.40%～16.86%)的研究結(jié)果；雄性野豬在兩菌門間則無(wú)顯著差異，這可能與本研究個(gè)體的食物種類(冬季主要為植物，纖維素含量高)有關(guān)。雌性野豬放線菌門(6.86%)顯著低于Yang等[15](31.22%～46.66%)在河南的研究結(jié)果，這可能是由于兩研究地的食物、棲息環(huán)境以及個(gè)體的健康狀況等不同而存在顯著差異。本研究結(jié)果顯示，雌性野豬雙歧桿菌屬(4.54%)豐度顯著低于Yang等[15]的研究結(jié)果(22.48%)，與譚占坤等[11]研究的放牧藏豬結(jié)果相似(4.67%)，這說(shuō)明菌群豐度可能與野豬該時(shí)間段的健康狀態(tài)有關(guān)，存在一定的波動(dòng)范圍，與同樣在野外自由生長(zhǎng)的藏豬菌群豐度相似；乳酸菌屬(Lactobacillus)豐度(0.92%)與Wang等[12]的研究結(jié)果相近(1.45%)，乳酸菌與豬的生長(zhǎng)階段、健康狀態(tài)和個(gè)體差異等有關(guān)，不同生活史階段有一定差異[48]。

3.4 野豬盲腸PICRUSt功能預(yù)測(cè)

通過(guò)PICRUSt功能預(yù)測(cè)可知，研究區(qū)野豬盲腸細(xì)菌主要以碳水化合物代謝為主要途徑，這與能產(chǎn)生碳水化合物降解酶的瘤胃球菌屬[41]為優(yōu)勢(shì)菌屬顯著富集的結(jié)果相符；其次為氨基酸代謝途徑，總體上在地區(qū)和性別組間差異不顯著，相關(guān)研究表明膜轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在較肥胖的豬盲腸中較豐富[49]。本研究結(jié)果與Yang等[15]和Wang等[12]研究的PICRUSt功能有所差異，這應(yīng)該是由野豬生存環(huán)境、食性和個(gè)體狀況等不同所導(dǎo)致。分析得知，不同地區(qū)野豬循環(huán)系統(tǒng)和寄生蟲傳染病代謝途徑存在顯著差異(P<0.05)，雌雄性別間膜運(yùn)輸途徑存在顯著差異(P<0.05)，其他代謝途徑存在一定的異同。PICRUSt功能預(yù)測(cè)系與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，僅作為功能預(yù)測(cè)，具體生理生化功能還有待進(jìn)一步研究。研究結(jié)果顯示兩地區(qū)、雌雄性別間的野豬盲腸細(xì)菌組成及豐度差異不顯著，可能是因?yàn)閮傻貐^(qū)野豬喜食的食物、分布的微環(huán)境相似，盲腸中菌群相對(duì)穩(wěn)定以及種群遺傳分化不大等原因造成，具體因素有待進(jìn)一步地探究。

研究表明，貴州黔北與黔東南地區(qū)不同性別間野豬盲腸細(xì)菌的組成、豐度和PICRUSt基因功能差異均不顯著，但不同個(gè)體間有一定的異同，菌群多樣性高于河南野豬、重慶圈養(yǎng)野豬和藏豬；PICRUSt基因預(yù)測(cè)功能以碳水化合物代謝途徑為主，其次為氨基酸代謝途徑。腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)多樣性及其豐富度受多種因素的影響，從而也決定著菌群的功能多樣性，掌握腸道菌群多樣性可為研究其功能作用及其生理生化特性提供重要的基礎(chǔ)信息。

致謝：感謝貴州省林業(yè)局、各地林業(yè)局(自然資源局)及自然保護(hù)區(qū)管理局的大力配合和幫助，在采樣過(guò)程中也得到了貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院張飄、張?zhí)焯旒百F州師范大學(xué)生命科學(xué)院呂小燕、李斌強(qiáng)等多名同學(xué)幫助，在此一并致謝！