豬CYP11A1基因編碼區(qū)擴增及核心啟動子區(qū)的鑒定與分析

曾強,關欽澤,王思琪,李齊發(fā),杜星

(南京農業(yè)大學動物科技學院,江蘇 南京 210095)

細胞色素450家族(cytochrome P450 family,又稱CYP450 family)是由一類能發(fā)生自氧化的富含亞鐵血紅素蛋白組成的龐大家族,因該家族成員在450 nm激發(fā)波長照射下具有特定的吸收峰而得名[1]。其中,膽固醇側鏈裂解酶(cholesterol side-chain cleavage enzyme)作為其中一個重要的亞家族得到了廣泛關注[2]。經鑒定該亞家族中存在多個成員,包括CYP11A1、CYP11B1、CYP17B1、CYP19A1以及CYP21A1等[3]。該亞家族成員廣泛參與調控哺乳動物體內眾多關鍵的生理過程,包括能量代謝、免疫調節(jié)、應激適應、穩(wěn)態(tài)平衡、性別分化以及性腺形成與性器官成熟等[4]。其中,細胞色素P450側鏈膽固醇單加氧酶(CYP11A1)作為類固醇激素合成的第一步關鍵作用酶得到了廣泛關注[5]。細胞定位分析發(fā)現CYP11A1蛋白貫穿于線粒體內膜上,其分子功能主要是催化膽固醇與孕烯醇酮(大多數類固醇激素前體)發(fā)生側鏈裂解反應,進而促進孕烯醇酮及其下游類固醇激素的生物學合成[6]。組織表達譜分析也證實CYP11A1基因主要在哺乳動物的腎上腺、睪丸、卵巢以及子宮等類固醇激素分泌旺盛的組織高表達[7]。

21世紀初對雌性哺乳動物卵巢組織中CYP11A1基因的研究多見于卵泡膜細胞中[8-9]。隨著對卵巢組織中雌二醇合成過程的深刻解析,近年來的相關研究表明雌二醇的合成依賴“兩細胞學說”,即依賴卵泡膜細胞(thecal cell)與顆粒細胞(granulosa cell)。該學說證實CYP11A1基因在上述2種細胞中均高表達,并且其編碼蛋白膽固醇側鏈裂解酶(P450scc)可將膽固醇轉化為孕烯醇酮,這是雌二醇合成的第一步關鍵限速步驟,該過程同時發(fā)生在2種細胞中[10];另外,依賴最后一步關鍵限速酶(P450arom)可將雄激素轉化為雌二醇,但該過程僅發(fā)生在顆粒細胞中。因此,近年來在卵巢組織中研究雌二醇合成與分泌過程多見于顆粒細胞中[11-12]。由此,本研究選擇在顆粒細胞中對CYP11A1基因進行相關試驗。

自發(fā)現至今,CYP11A1基因在生物學領域中的研究主要集中在雌性哺乳動物卵巢組織發(fā)育、功能發(fā)揮以及生殖疾病等方面[13-14]。對CYP11A1編碼基因的研究卻鮮有報道,同時其表達調控機制尚不完全清楚。目前對該基因的探究(表達調控與生物學功能方面)主要集中在人[15]與小鼠[16]上,而在豬等家畜動物中的研究較少,其關鍵的理化性質與表達調控機制尚未見報道。因此,本研究以豬CYP11A1基因為研究對象,通過基因克隆測序獲得其編碼區(qū)全長序列并對其序列特征進行分析;鑒定豬CYP11A1基因的核心啟動子區(qū)并在豬卵巢顆粒細胞中分析轉錄因子NR2C1對豬CYP11A1基因轉錄活性與表達水平的影響,為進一步探究CYP11A1基因轉錄調控機制以及類固醇激素合成通路的調控模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機選取180日齡健康的杜長大三元雜交母豬(南京竹順生物有限公司),屠宰后采集雙側卵巢,立即置37 ℃生理鹽水中并于2 h內帶回實驗室,用于豬卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)與卵巢組織總RNA的提取。

1.2 豬卵巢顆粒細胞的分離與體外培養(yǎng)

利用預熱的75%乙醇和生理鹽水將采集的新鮮豬卵巢反復輕柔沖洗數次,以徹底去除其表面的血漬及可能殘留的污染源。利用10 mL注射器抽取直徑3～5 mm健康卵泡的卵泡液,1 200 r·min-1離心5 min,吸棄上層渾濁卵泡液,再利用37 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并輕柔吹打清洗細胞2次。將充分重懸的顆粒細胞以合適的密度接種在含有適量培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分:DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、15%胎牛血清以及1%青/鏈霉素。靜置36 h待細胞牢固貼壁后,利用37 ℃PBS清洗細胞以去除非貼壁細胞與死亡細胞,用于后續(xù)試驗。

1.3 細胞總RNA的提取及反轉錄(RT)

采用Trizol試劑提取體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞的總RNA,再利用氯仿-異丙醇法對顆粒細胞總RNA進行純化,純化后的RNA于-80 ℃長期保存。利用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒(南京諾唯贊公司)制備cDNA。具體過程如下:吸取500 ng細胞總RNA,加入2 μL 4×gDNA weeper MIX,混合均勻后42 ℃反應2 min,用于去除殘留的DNA,隨后在上述反應體系中加入2 μL 5×HiScript Ⅲ qRT Super Mix,混合均勻后進行反轉錄(RT)。RT反應條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。最終利用DEPC水將獲得的cDNA樣品稀釋2～3倍后于-80 ℃保存。

1.4 引物設計與PCR擴增和測序

通過NCBI上GenBank數據庫獲得豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列(NM_214427.1),利用Primer Premier 5.0軟件設計4對相應的擴增引物。針對豬CYP11A1基因的5′調控區(qū)序列設計5對引物,用于構建缺失表達載體。根據豬CYP11A1、NR2C1(XM_013998075.2)以及GAPDH(NM_001206359.1)基因編碼區(qū)序列分別設計定量引物并交上海生工生物工程股份有限公司合成。引物詳細信息見表1。

通過PCR擴增獲得相應的序列。20 μL PCR反應體系:2×VazymeLAmp?Master Mix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50～60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min·kb-1(35個循環(huán));72 ℃ 5 min;4 ℃保存。擴增產物使用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測,利用凝膠成像系統(tǒng)(美國BIORAD公司)獲取高分辨率圖像。對清晰、單一的目的條帶切膠后,送南京擎科公司測序,再用DNAMAN v6.0和Chromas Pro軟件進行分析。

表1 本試驗涉及的引物信息Table 1 Primer information involved in this experiment

1.5 載體構建與熒光素酶活性試驗

為了構建缺失表達載體,利用P5—P9引物擴增的產物以及pGL3-Basic線性載體用限制性內切酶KpnⅠ與XhoⅠ進行雙酶切,經T4連接酶連接后轉化至感受態(tài)DH5α中,隨后將單克隆菌落進行平板劃線擴大培養(yǎng),最終獲得相應的陽性重組質粒,并將其命名為pCYP11A1;豬NR2C1基因的真核生物表達載體pcDNA3.1-NR2C1來源于本課題組前期構建。

熒光素酶活性試驗:在豬卵巢顆粒細胞中完成。轉染24 h后,收集細胞并用熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)檢測樣品中的螢火蟲熒光與海腎熒光活性。熒光相對活性為螢火蟲熒光與海腎熒光的比值。每組設立3個獨立重復樣本。

1.6 RT-qPCR檢測基因的表達水平

轉染24 h后,收集體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞,按上述方法提取細胞總RNA后,反轉錄成cDNA。以cDNA為模板,用AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(南京諾唯贊公司)對NR2C1和CYP11A1基因mRNA水平進行定量分析。所用引物序列見表1。以GAPDH作為內參基因。每組設立3個重復樣本,采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達水平

體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞轉染48 h后,使用預冷的RIPA細胞裂解緩沖液裂解細胞,4 ℃、12 000 r·min-1離心3 min,收集上清液即為細胞總蛋白裂解物。采用BCA法測定每個蛋白質樣品的濃度,然后稀釋成同一濃度后于-20 ℃保存。利用Western blot對CYP11A1蛋白表達水平進行檢測。具體操作參見文獻[17]。本試驗采用0.25%牛血清白蛋白(BSA)溶液稀釋抗體。試驗所用一抗如下:兔NR2C1抗體(1∶1 000,Abconal)、兔CYP11A1抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)、鼠GAPDH抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)。二抗有辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔lgG抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)以及山羊抗小鼠lgG抗體(1∶1 000,Sangon Biotech)。

1.8 染色質免疫沉淀(ChIP)檢測轉錄因子NR5A1與CYP11A1基因啟動子區(qū)的結合

ChIP試驗具體步驟參照文獻[18]。用1%甲醛溶液固定顆粒細胞10 min,加入甘氨酸終止交聯(lián)。用超聲波破碎儀將交聯(lián)染色質切割成500 bp左右的片段,使用5 μg兔NR2C1抗體(Abconal)在豬卵巢顆粒細胞中分離CYP11A1-DNA復合物,用酚氯仿提取純化目的蛋白上的DNA,通過PCR分析獲取DNA片段富集情況。以辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔lgG抗體作為陰性對照,未進行處理的染色質作為總樣本對照。ChIP試驗所用引物信息見表1。

1.9 生物信息學分析

利用BioXM 2.6和DNAMAN v6.0軟件對豬CYP11A1基因編碼區(qū)核苷酸序列進行分析。利用BDGP數據庫(https://fruitfly.org/seqtools/promoter.html)和Promoter 2.0 Prediction Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)對豬CYP11A1基因的潛在核心啟動子區(qū)進行初步預測。利用EMBOSS Cpgplot與MethPrimer在線分析系統(tǒng)對豬CYP11A1基因5′調控區(qū)潛在的CpG島進行預測。利用JASPAR在線數據庫(http://jaspar.genereg.net/)分析豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)潛在的轉錄因子結合位點。

1.10 數據分析

采用GraphPad v8.0軟件與IBM SPSS 20.0軟件對數據進行方差分析,然后利用雙尾t檢驗分析2組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列擴增

利用引物P1—P4對豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列進行PCR擴增(圖1-A),擴增產物經15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果表明:在相應的退火溫度下均能得到單一、清晰、明亮且與設計目的長度一致的特異性擴增條帶(圖1-B)。通過克隆測序證實,利用P1—P4引物對的特異性擴增片段長度依次為492、519、463和480 bp,與預期目的片段長度一致。

圖1 豬CYP11A1基因編碼區(qū)PCR擴增產物Fig.1 The PCR amplified product of the coding region of the pig CYP11A1 gene A.CYP11A1編碼區(qū)序列擴增示意圖;B.P1—P4引物對的擴增產物(M:2 000 bp標準品)。A.Schematic diagram of amplification of CYP11A1 coding region sequence;B.P1-P4 amplification product(M:2 000 bp marker).

2.2 豬CYP11A1基因編碼區(qū)核苷酸序列特征分析

PCR產物經克隆、測序以及序列拼接后,獲得豬CYP11A1基因編碼區(qū)全序列,序列長度為1 563 bp(圖2-A),與豬基因組序列信息比對后發(fā)現豬CYP11A1基因由9個外顯子與8個內含子組成(圖2-B)。采用BioEdit 7.0軟件對豬CYP11A1基因核苷酸序列的堿基組成進行分析,發(fā)現豬CYP11A1基因核苷酸序列中A、T、C、G堿基數分別為378、348、435、402個,分析堿基含量發(fā)現嘌呤堿基(A+G)含量為49.9%,嘧啶含量(C+T)為50.1%,表明A+G含量與C+T含量基本相當(圖2-C)。通過BLAST對比分析豬CYP11A1基因編碼區(qū)序列與人(NM_000781.3)、牛(NM_176644.2)、綿羊(NM_001093789.1)、馬(NM_001082521.1)、兔(XM_008253734.2)以及黑猩猩(NM_001280408.1)等哺乳動物的相似性分別為84.16%、87.84%、87.40%、84.77%、78.16%、83.78%;而與雞(NM_001001756.1)和斑馬魚(NM_152953.2)等非哺乳動物的相似性分別為58.85%和48.41%(圖2-D),表明CYP11A1基因在哺乳動物中具有較高的序列保守性。進一步分析序列進化保守性發(fā)現CYP11A1基因在豬、牛和綿羊等哺乳動物中具有較高程度的進化保守性(圖2-E)。

2.3 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)鑒定

為了鑒定豬CYP11A1基因的核心啟動子區(qū),根據豬CYP11A1基因5′調控區(qū)序列設計了5對特異性引物P5—P9,能在最適退火溫度下得到清晰、明亮且符合預期大小的電泳條帶(圖3-A)。將目的條帶進行切膠回收、純化、克隆測序與序列拼接最終獲得豬CYP11A1基因 5′調控區(qū)序列,并成功構建相應的缺失表達熒光報告載體(圖3-B)。分別將各個重組質粒瞬時轉染體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞,熒光素酶活性試驗結果顯示pCYP11A1-140與pCYP11A1-430之間的熒光活性呈現顯著差異,即pCYP11A1-430的熒光活性極顯著高于pCYP11A1-140(P<0.01,圖3-C),表明豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)位于-398～-108 bp(轉錄起始位點作為+1)。

圖2 豬CYP11A1基因編碼區(qū)核苷酸序列特征分析Fig.2 Characteristic analysis of the nucleotide sequence of the coding region of pig CYP11A1 gene A.編碼區(qū)核苷酸序列;B.序列組成;C.序列堿基含量;D.序列同源性分析;E.進化保守性分析。A.Coding region nucleotide sequence;B.Sequence composition of coding region;C.Sequence composition;D.Sequence homology analysis;E.Evolutionary conservation analysis.

圖3 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)鑒定Fig.3 Identification of the core promoter region in pig CYP11A1 geneA.P5—P9引物產物(M:2 000 bp標準品);B.構建載體的示意圖;C.熒光素酶活性試驗。A.P5-P9 amplification product(M:2 000 bp marker);B.Schematic diagram of vector construction;C.Luciferase activity test.

2.4 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)序列特征分析

序列分析發(fā)現豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)由291個堿基組成(圖4-A),其中A堿基61個(21%)、T堿基89個(30.6%)、C堿基63個(21.6%)、G堿基78個(26.8%)。嘌呤堿基(A+G)含量為47.8%,嘧啶含量(C+T)為52.2%,表明A+G含量略低于C+T含量(圖4-B)。利用JASPAR在線數據庫分析發(fā)現豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)包含多個潛在的轉錄因子結合位點,例如核受體亞家族2C組成員1(nuclear receptor subfamily 2,group C,member 1,NR2C1)、SRY-盒轉錄因子10(SRY-box transcription factor 10,SOX10)、核因子Ⅸ(nuclear factor Ⅸ,NFIX)和E74樣ETS轉錄因子5(E74 like ETS transcription factor 5,ELF5)等(圖4-C)。通過在線軟件EMBOSS分析發(fā)現,在豬CYP11A1基因啟動子區(qū)共鑒定15個潛在的甲基化位點(CG位點),其中4個位點定位于近端啟動子區(qū)(0～-400 bp)、8個位于中遠端啟動子區(qū)(-800～-1 200 bp)、3個位于遠端啟動子區(qū)(-1 200～-1 600 bp)(圖4-D);在線軟件MethPrimer分析發(fā)現在豬CYP11A1基因近端、中遠端和遠端啟動子區(qū)有3個潛在的高甲基化區(qū)域,跟甲基化位點(CG位點)的位置是對應的(圖4-E),但并未預測到相應的CpG島。提示豬CYP11A1基因的轉錄可能在一定程度上受DNA甲基化的影響。

圖4 豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)序列特征分析Fig.4 Sequence analysis of porcine CYP11A1 gene core promoter region 1)A.核心啟動子區(qū)堿基組成Base composition and ratio of core promoter region;B.核心啟動子區(qū)堿基數及組成Base number and composition of core promoter region;C.潛在轉錄因子生物信息學分析Bioinformatics analysis of potential transcription factors;D.利用EMBOSS Cpgplot分析CG位點Analysis of CG sites by EMBOSS Cpgplot;E.利用MethPrimer分析甲基化區(qū)域Analysis of methylated regions by MethPrimer。2)NR2C1:核受體亞家族2C組成員1 Nuclear receptor subfamily 2,group C,member 1;MAZ:MYC相關鋅指蛋白 MYC associated zinc finger protein;ELF5:E74樣ETS 轉錄因子5 E74 like ETS transcription factor 5;NR2F1:核受體亞家族2F組成員1 Nuclear receptor subfamily 2 group F member 1;ZNF263:鋅指蛋白263 Zinc finger protein 263;VDR:維生素D受體 Vitamin D receptor;ZBTB6:鋅指和BTB結構域6 Zinc finger and BTB domain containing 6;NFATC2:活化T細胞的核因子2 Nuclear factor of activated T cells 2;ZBTB12:鋅指和BTB結構域12 Zinc finger and BTB domain containing 12;NFIX:核因子IX Nuclear factor IX;SOX10:SRY-box轉錄因子10 SRY-box transcription factor 10;FOXC1:叉頭盒C1 Forkhead box C1;FOXL1:叉頭盒L1 Forkhead box C1.

2.5 轉錄因子NR2C1對豬卵泡顆粒細胞中CYP11A1基因轉錄的影響

根據圖4-C的分析結果可知,轉錄因子NR2C1與豬CYP11A1基因的核心啟動子區(qū)存在較強的互作結合能力(預測分值為11.039 00),因此選擇轉錄因子NR2C1進行后續(xù)研究。首先將重組質粒pcDNA3.1-NR2C1瞬時轉染體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞,分別通過RT-qPCR和Western blot方法檢測NR2C1的mRNA與蛋白表達水平。結果發(fā)現,轉染pcDNA3.1-NR2C1能夠極顯著上調豬卵巢顆粒細胞中NR2C1基因mRNA(圖5-A,P<0.01)與蛋白表達水平(圖5-B,P<0.05),表明豬NR2C1基因真核生物表達載體構建成功。根據JASPAR數據庫信息,CYP11A1核心啟動子區(qū)有1個潛在的轉錄因子NR2C1的結合位點。RT-qPCR和Western blot結果證實NR2C1過表達可極顯著促進豬卵巢顆粒細胞中CYP11A1基因mRNA(圖5-C,P<0.01)與蛋白表達水平(圖5-D,P<0.01)。另外,熒光素酶活性試驗證實,NR2C1過表達能夠極顯著促進CYP11A1基因核心啟動子區(qū)轉錄活性(圖5-E,P<0.01)。通過ChIP試驗證實在豬卵巢顆粒細胞中,轉錄因子NR2C1能夠與CYP11A1基因核心啟動子區(qū)特異性結合(圖5-F)。上述結果表明在豬卵巢顆粒細胞中,轉錄因子NR2C1能夠通過上調CYP11A1基因核心啟動子區(qū)活性來促進其轉錄。

圖5 轉錄因子NR2C1對豬卵巢顆粒細胞中CYP11A1基因和蛋白表達的影響Fig.5 Effects of transcription factor NR2C1 on gene and protein expression of CYP11A1 in porcine ovarian granulosa cells A.RT-qPCR檢測NR2C1 mRNA的表達水平;B.Western blot檢測NR2C1蛋白的表達水平;C.過表達NR2C1對CYP11A1 mRNA水平的影響;D.過表達NR2C1對CYP11A1蛋白水平的影響;E.過表達NR2C1對CYP11A1基因核心啟動子活性的影響;F.ChIP試驗鑒定NR2C1與CYP11A1核心啟動子的結合特性(M:2 000 bp DNA標準品;Blank:空白對照;Input:陽性對照)。A.The mRNA levels of NR2C1 are measured by RT-qPCR;B.The protein levels of NR2C1 are detected by Western blot;C.The effect of NR2C1 overexpression on CYP11A1 mRNA expression level;D.The effect of NR2C1 overexpression on the protein expression level of CYP11A1;E.The effect of NR2C1 overexpression on the activity of CYP11A1 gene core promoter;F.ChIP assay was performed to analyze the enrichment of NR2C1 on the core promoter of CYP11A1(M indicates 2 000 bp DNA marker;Blank indicates blank control;Input indicates positive control).

3 討論

自20世紀80年代CYP11A1基因首次在人體組織中發(fā)現以來,CYP11A1基因與其編碼蛋白相繼在鼠[19]、牛[20]、綿羊[21]等多個哺乳動物中成功鑒定,然而目前關于豬CYP11A1基因及其編碼蛋白結構與功能的研究卻鮮有報道。本研究通過克隆擴增與測序技術獲得了豬CYP11A1基因編碼區(qū)全序列,再通過對CYP11A1基因編碼區(qū)序列同源性比較發(fā)現其核苷酸序列與其他哺乳動物的一致性均高于84%,表明CYP11A1基因在哺乳動物進化過程中具有高度保守性,這也從另一方面說明CYP11A1基因在哺乳動物中所發(fā)揮的相關生物學功能是穩(wěn)定和必不可少的。在蛋白質構成方面,CYP11A1蛋白與其他糖蛋白和具有潛伏肽的蛋白不同,其僅由1個相對分子質量約為50×103的蛋白質肽鏈構成。有研究表明CYP11A1蛋白在正常狀態(tài)下并不存在相關蛋白修飾,這對其功能的完整性和敏感性至關重要[22]。研究表明MTS突變可導致CYP11A1發(fā)生折疊錯誤并引起定位改變,進而在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase pim-1,PIM1)的作用下降解[23];另外,F-G loop作為CYP11A1蛋白特異性功能結構域在識別、結合及催化線粒體內類固醇的過程中起到至關重要的作用[24]。研究證實CYP11A1蛋白存在的一系列功能結構域與其亞細胞定位、空間結構以及功能完整性相關。因此,我們的后續(xù)研究將會著重探討豬CYP11A1蛋白結構域對CYP11A1蛋白功能的影響以及對母豬繁殖性狀調控的分子機制。

近年來,研究發(fā)現CYP11A1作為類固醇激素的第一步合成酶,其表達與活性的異?？蓪е露喾N疾病的發(fā)生,主要包括幼兒與老人腎功能不全、雌性繁殖障礙、免疫障礙以及癌癥等[25-26]。然而,目前僅在人和小鼠中對CYP11A1基因表達調控機制進行了探究,而對豬等大型家畜CYP11A1基因的表達調控機制少有報道[27]。因此,本研究首先通過構建缺失表達載體與熒光素酶活性試驗鑒定了豬CYP11A1基因核心啟動子位于近端調控區(qū),而這與前人對人和小鼠等哺乳動物的研究一致,證實哺乳動物CYP11A1基因的核心啟動子位于近端500 bp范圍內[28]。另外,轉錄調控是基因表達的重要環(huán)節(jié),轉錄啟動是眾多順式作用元件與反式作用因子相互作用的結果[29]。前人研究證實人與小鼠CYP11A1近端核心啟動子區(qū)主要受到剪接因子1(splicing factor 1,SF-1)[30]、特異性蛋白1(specificity protein 1,SP1)[31]以及神經纖維蛋白1(neurofibromin 1,NF-1)[32]等轉錄因子的調控,而本研究利用生物信息學分析發(fā)現,除了上述幾個已確定的轉錄因子外,豬CYP11A1基因核心啟動子區(qū)還包含其他多種轉錄因子的結合元件,例如核受體亞家族2C組成員1(nuclear receptor subfamily 2,group C,member 1,NR2C1)、SRY-box轉錄因子10(SRY-box transcription factor 10,SOX10)、核因子Ⅸ(nuclear factor Ⅸ,NFIX)和E74樣ETS轉錄因子5(E74 like ETS transcription factor 5,ELF5)等,以上結果提示這些轉錄因子可能在豬CYP11A1基因轉錄啟動過程中發(fā)揮重要作用。本研究證實NR2C1過表達可顯著促進CYP11A1基因核心啟動子區(qū)活性,同時顯著上調體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中CYP11A1基因的轉錄水平,為解析豬CYP11A1基因轉錄調控機制以及拓展類固醇合成的調控網絡提供了一定的參考。另外,DNA甲基化與組蛋白修飾是哺乳動物基因表達過程中最為常見的表觀遺傳修飾,它們可以誘導基因在生物體正常生理或病理狀態(tài)下的表達與沉默[33]。DNA甲基化與組蛋白修飾相關,這些表觀遺傳修飾的相互作用對于通過改變染色質構象調控基因組功能至關重要[34]。本研究通過生物信息學軟件分析發(fā)現豬CYP11A1基因啟動子區(qū)存在15個潛在的甲基化位點(CG位點),其中有4個位于近端核心啟動子區(qū),而這與前人的研究結果基本一致[35]。但與其他哺乳動物研究不同的是,我們在豬CYP11A1基因的中端與遠端啟動子上分別發(fā)現了多個潛在的甲基化位點,推測豬CYP11A1基因轉錄可能在一定程度上受到DNA甲基化的影響,但更深層次的機制仍需要進一步探究。