油菜秸稈高效降解菌的篩選及其雙功能纖維素酶性質(zhì)研究

李凌波,許歡歡,夏燕維,郭傳旭,楊明珠,馬磊,繆有志,劉東陽,張瑞福

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

農(nóng)作物秸稈是自然界中豐富且廉價(jià)的生物質(zhì)資源,相較于煤炭、石油、天然氣等化石能源具有可再生性。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國,秸稈資源豐富,全國秸稈總年產(chǎn)量高達(dá)10億t左右,占世界秸稈總年產(chǎn)量的20%～30%。因此,秸稈資源的高效利用在緩解能源危機(jī)、提高土壤肥力、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展等方面具有重要意義[1]。

纖維素作為農(nóng)作物秸稈的重要組成部分,物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其由成千上萬個(gè)D-吡喃型葡萄糖殘基通過β-1,4-糖苷鍵連接而成,是一種不溶于水的天然高分子多糖類聚合物[2]。相較物理、化學(xué)等處理方法而言,利用微生物分泌纖維素酶降解纖維素類生物質(zhì)具有反應(yīng)條件溫和、成本低、污染小、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[3],已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、飼料加工、紡織工業(yè)等領(lǐng)域。其中,真菌產(chǎn)纖維素酶多為胞外酶,菌絲可穿過細(xì)胞壁插入胞內(nèi),由內(nèi)而外降解纖維素,較細(xì)菌和放線菌更具降解優(yōu)勢(shì)[4]。纖維素酶是一個(gè)多酶體系,通過協(xié)同作用將天然纖維素水解生成低聚糖并最終轉(zhuǎn)化成葡萄糖。按照其催化模式以及不同的結(jié)構(gòu)特征,將纖維素酶系中的酶組分分為3類,分別是內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,EC 3.2.1.4),又稱Cx酶或CMC酶;外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase,EC 3.2.1.91)又稱C1酶;以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases,EC 3.2.1.21),又稱CB酶[5]。目前,纖維素酶過高的生產(chǎn)成本嚴(yán)重制約了生物質(zhì)的經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)化及其增值產(chǎn)品的生產(chǎn)。與融合酶、多酶混合物相比,雙功能酶不僅克服了在生產(chǎn)過程中可能會(huì)出現(xiàn)的部分人工連接效應(yīng)、結(jié)構(gòu)域意外錯(cuò)誤折疊、蛋白產(chǎn)量低等局限性,而且有效降低了酶生產(chǎn)、純化以及裝載的成本,大幅提高了木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解速率及行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[6-8]。因此,克隆表達(dá)出具有雙功能或多功能的纖維素酶將有助于推動(dòng)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)工業(yè)的發(fā)展[9]。

油菜居我國五大油料作物之首,我國油菜生產(chǎn)面積和產(chǎn)量常年位居世界首位[10],而油菜秸稈本身過高的木質(zhì)纖維素含量使秸稈內(nèi)各組分通過不同的結(jié)合力而緊密交聯(lián),導(dǎo)致油菜秸稈的利用效率遠(yuǎn)不及水稻、小麥、玉米等主要糧食作物秸稈[11]。同時(shí),由于油菜秸稈“體積大、重量輕”的特點(diǎn)以及收獲后搶種水稻等原因,其在農(nóng)村的主要處置方式仍為直接廢棄或露天焚燒,這不僅造成了資源的大量浪費(fèi),同時(shí)引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[12]。本研究從腐爛油菜秸稈田土樣中分離篩選出1株可以高效降解油菜秸稈的真菌綠色木霉(Trichodermaviride)A15,研究菌株A15對(duì)油菜秸稈的降解特性,并對(duì)其雙功能纖維素酶基因進(jìn)行克隆和異源表達(dá),旨在為油菜秸稈的高效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與處理在南京市江寧區(qū)世凹桃園油菜田采集腐爛油菜秸稈及其土壤樣品以供菌株篩選。用自來水反復(fù)沖洗新鮮油菜秸稈以去除其表面的泥土與雜質(zhì),烘干并用粉碎機(jī)粉碎后,將樣品置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、表達(dá)宿主畢赤酵母(Pichiapastoris)X33、載體pPICZαA均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

PDA培養(yǎng)基:200 g·L-1馬鈴薯,20 g·L-1葡萄糖。LB培養(yǎng)基:3 g·L-1NaCl,5 g·L-1酵母粉,10 g·L-1蛋白胨。富集培養(yǎng)基:在250 mL錐形瓶中加入5 g油菜秸稈粉,0.9 g·L-1NaCl,0.3 g·L-1(NH4)2SO4,0.1 mol·L-1PBS緩沖液(pH7.4)90 mL。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基:1 g·L-1KH2PO4,1 g·L-1NH4NO3,0.5 g·L-1MgSO4·7H2O,15 g·L-1CMC-Na,1 g·L-1酵母粉。無機(jī)鹽培養(yǎng)基:18 g·L-1KH2PO4,5.9 g·L-1(NH4)2SO4,0.5 g·L-1MgSO4·7H2O,0.8 g·L-1CaC12,5 mg·L-1FeSO4·7H2O,1.6 mg·L-1MnSO4·H2O,1.4 mg·L-1ZnSO4·7H2O,2 mg·L-1CoC12·6H2O。秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基:在50 mL錐形瓶中加入2.0 g油菜秸稈粉,5 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基,滅菌后加入1 mL 1.0×107CFU·mL-1菌株孢子懸液,調(diào)節(jié)其含水率為75%。秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基:在250 mL錐形瓶中加入1.0 g油菜秸稈粉,100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基。YPDS培養(yǎng)基:20 g·L-1葡萄糖,10 g·L-1酵母粉,20 g·L-1蛋白胨,182 g·L-1山梨醇。BMGY培養(yǎng)基:10 g·L-1甘油,10 g·L-1酵母粉,20 g·L-1蛋白胨,13.4 g·L-1YNB,11.81 g·L-1KH2PO4,3.01 g·L-1K2HPO4。

1.2 菌株的富集、分離與篩選

稱取10 g采集的土樣置于250 mL錐形瓶中,加入90 mL無菌水,在28 ℃、170 r·min-1條件下振蕩 60 min,吸取5 mL懸濁液轉(zhuǎn)接至新鮮的富集培養(yǎng)基中,28 ℃、170 r·min-1條件下培養(yǎng)48 h,如此重復(fù)轉(zhuǎn)接3次。采用稀釋涂布平板法,將富集液分別進(jìn)行10-4、10-5、10-6梯度稀釋,分別取100 μL稀釋液涂布到PDA平板上,每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù),28 ℃培養(yǎng)7 d。觀察平板中菌落的生長情況,挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。通過剛果紅-透明圈試驗(yàn)對(duì)純化后的菌株進(jìn)行初篩[13]。觀察透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)來初步判斷該菌株降解纖維素的能力。添加1 mL 1.0×107CFU·mL-1菌株孢子懸液于秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃靜置發(fā)酵7 d后進(jìn)行破壞性取樣。取1 g發(fā)酵后的秸稈樣品于錐形瓶中,加入10 mL去離子水,在28 ℃、170 r·min-1條件下振蕩60 min。4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min,上清液即為粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定菌株濾紙酶(FPA)活性及纖維素內(nèi)切酶(CMC)活性[14],每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。酶活性定義:在50 ℃條件下,1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA平板中央,周圍插放蓋玻片使菌絲能夠向蓋玻片上生長,28 ℃培養(yǎng)3 d后,用無菌鑷子夾取布滿菌絲的蓋玻片,置于載玻片上,在顯微鏡下觀察菌株菌落特征、菌絲、分生孢子梗和分生孢子。將不同時(shí)期的固體發(fā)酵油菜秸稈樣品取出,浸泡在新配制的2.5%戊二醛溶液中,4 ℃固定8 h以上。經(jīng)PBS清洗、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥后,將樣品用雙面膠粘貼至樣品觀察臺(tái)上,進(jìn)行鍍膜,隨后利用掃描電鏡對(duì)秸稈樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

使用DNeasy Power Soil Pro Kit(QIAGEN公司)提取菌株DNA,以基因組DNA為模板,采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。PCR擴(kuò)增體系(50 μL):GreenTaqMix 25 μL,ITS1引物2 μL,ITS4引物2 μL,DNA模板4 μL,無菌水17 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s(32個(gè)循環(huán));72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析,并將ITS測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行相似性比對(duì)分析,最后用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 常規(guī)化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

添加1 mL 1.0×107CFU·mL-1菌株A15孢子懸液于油菜秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),分別于培養(yǎng)1、3、7、14、21和28 d后進(jìn)行破壞性取樣。利用差重法計(jì)算秸稈失重率,采用改進(jìn)后的范式洗滌法(Van Soest)測(cè)定油菜秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量,使用總有機(jī)碳/總氮分析儀測(cè)定水溶性碳、水溶性氮含量,利用碳氮元素分析儀測(cè)定總碳、總氮含量[15]。每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)定3次。

1.5 模擬秸稈還田盆栽試驗(yàn)

于2021年6—7月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園進(jìn)行盆栽試驗(yàn),試驗(yàn)期間室外溫度為20～35 ℃,供試土壤采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地當(dāng)季收獲后的油菜田土壤。每個(gè)盆栽裝置裝3 kg土樣,用150 μm尼龍網(wǎng)帶裝入4 g油菜秸稈(長度約為2～3 cm)后埋入土內(nèi)約3 cm處。設(shè)置處理組(秸稈與1.0×107CFU·mL-1菌株A15孢子懸液的質(zhì)量體積比為1∶1混勻)以及對(duì)照組(秸稈與等量無菌水充分混勻),試驗(yàn)過程中不斷補(bǔ)充水分,以保證含水率為60%～80%。分別于培養(yǎng)10、20和30 d后取樣,測(cè)定秸稈的失重率,各時(shí)期樣品均重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 纖維素酶酶譜分析及質(zhì)譜鑒定

添加1 mL 1.0×107CFU·mL-1菌株A15孢子懸液于油菜秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃、170 r·min-1條件培養(yǎng)7 d,4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min,上清液即為粗酶液。選用生工生物工程(上海)股份有限公司的Precast-Glgel 12%非變性電泳Hepes預(yù)制膠,將15 μL粗酶液與15 μL 2×非變性蛋白上樣緩沖液均勻混合后上樣,以100 V電壓低溫電泳5 h。電泳結(jié)束后,將一半凝膠進(jìn)行活性染色,一半凝膠進(jìn)行普通考染[16]。將目的膠條切下送至杭州景杰生物科技股份有限公司進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)。

1.7 目的基因的克隆與重組表達(dá)載體的構(gòu)建

利用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)提取菌株RNA,以菌株總RNA作為模板,利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。通過質(zhì)譜鑒定結(jié)果可以得到celI基因序列,對(duì)其酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析,同時(shí)結(jié)合基因本身的信號(hào)肽序列,設(shè)計(jì)出用于畢赤酵母異源表達(dá)的特異性引物。

以菌株cDNA作為模板,使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(50 μL):2×Phanta Max Buffer 25 μL,dNTP Mix 1 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,Primer F(5′-GGAATTCCAGCAGCCTGGAACTAGCAC-3′)2 μL,Primer R(5′-GCTCTAGACAGTCATTGTT GTACTGGCA-3′)2 μL,cDNA模板1 μL,無菌水18 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 2 min(32個(gè)循環(huán));72 ℃ 5 min。利用10 g·L-1瓊脂糖凝膠對(duì)目的基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),采用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)對(duì)目的片段進(jìn)行凝膠回收。

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ對(duì)目的基因及表達(dá)載體pPICZαA進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系:EcoRⅠ10 μL,XbaⅠ10 μL,10×M Buffer 10 μL,目的基因/表達(dá)載體質(zhì)粒30 μL,無菌水40 μL。置于37 ℃恒溫酶切20 h后,清潔回收酶切產(chǎn)物,采用T4連接酶進(jìn)行酶連。酶連體系:10×T4DNA Ligase Buffer 2 μL,T4DNA Ligase 1 μL,雙酶切pPICZαA載體0.5 μL,雙酶切目的基因2 μL,無菌水14.5 μL。16 ℃酶連過夜,再利用熱激法將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中[17]。

1.8 纖維素酶CelI在畢赤酵母中的異源表達(dá)及純化

采用FastPure Plasmid Mini Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)提取重組質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶MssⅠ酶切重組質(zhì)粒。反應(yīng)體系:MssⅠ 5 μL,10×Buffer B 10 μL,重組質(zhì)粒10 μg,無菌水補(bǔ)足至100 μL。37 ℃酶切過夜,利用10 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

將線性化后的重組質(zhì)粒清潔回收,電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33感受態(tài)[17]。隨機(jī)挑取酵母重組轉(zhuǎn)化子,在裝有20 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR的八連管中充分?jǐn)噭?dòng),于85 ℃加熱15 min,作為菌落PCR反應(yīng)的模板。PCR擴(kuò)增體系(50 μL):2×TaqSuper Mix 25 μL,Primer F 2 μL,Primer R 2 μL,模板DNA 2 μL,無菌水19 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min(32個(gè)循環(huán));72 ℃ 5 min。10 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR電泳檢測(cè),將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接種于BMGY液體培養(yǎng)基內(nèi),30 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)24 h后,于每日同一時(shí)間添加1%(體積分?jǐn)?shù))甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。

采用硫酸銨沉淀法濃縮發(fā)酵液中的酶蛋白,利用Nuvia IMAC Ni-Charged鎳柱(Bio-Rad公司)純化目的蛋白。將蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按相應(yīng)比例混合,100 ℃反應(yīng)5 min使蛋白變性,隨后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后,對(duì)PAGE膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、分析[17]。

1.9 纖維素酶CelI酶學(xué)特性分析

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定純化蛋白的內(nèi)切葡聚糖酶活性,采用對(duì)硝基苯纖維二糖苷(pNPC)法測(cè)定純化蛋白的外切葡聚糖酶活性[14],以1 μmol·L-1酶溶液1 h內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖(或?qū)ο趸?定義為1個(gè)酶活性單位U。探究CelI最適反應(yīng)溫度時(shí),設(shè)置反應(yīng)溫度梯度為30、40、50、60、70和80 ℃;探究CelI溫度穩(wěn)定性時(shí),將純化蛋白分別在40、45、50、55和60 ℃條件下分別溫育0.5、1、2、4、6和8 h;探究CelI最適pH值時(shí),分別加入pH值為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的0.05 mol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液;探究不同金屬離子對(duì)CelI的影響時(shí),分別加入100 μL 0.05 mol·L-1的ZnCl2、MnCl2、FeCl3、CaCl2、NaCl、CoCl2溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜秸稈高效降解菌的分離篩選

從腐爛的油菜秸稈土樣中共分離純化出8株真菌,剛果紅透明圈篩選試驗(yàn)顯示不同菌株之間的透明圈差異較大,其中菌株A15的D/d值最大,為3.0。將初篩得到的8株真菌接種于以油菜秸稈為唯一碳源的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,測(cè)定其發(fā)酵7 d后的濾紙酶(FPA)活性和纖維素內(nèi)切酶(CMC)活性。從圖1可知:菌株A15的濾紙酶活性和內(nèi)切酶活性均顯著高于其他菌株,分別達(dá)16.13和8.16 U·g-1。綜合初篩以及復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果,最終獲得油菜秸稈高效降解菌株A15。

圖1 不同菌株的纖維素酶活性Fig.1 Cellulase activity of different strains 不同大、小字母表示不同樣本間在0.05水平差異顯著。Different capital and lowercase letters indicate that there is significant difference between different samples at the level of 0.05.

2.2 菌株A15的鑒定

將菌株A15接種在PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)7 d,觀察其形態(tài)特征。菌株生長迅速,初期產(chǎn)生絮狀白色菌絲體,3～4 d后表面變綠,產(chǎn)生孢子。在顯微鏡下進(jìn)一步觀察,可以明顯看到菌絲內(nèi)部有隔,可形成二級(jí)、三級(jí)分枝,分枝末端形成瓶狀小梗,小梗頂端簇生分生孢子,孢子多為橢圓形,無色或綠色(圖2)。依據(jù)文獻(xiàn)[18],可初步判定菌株A15為木霉屬真菌。提取菌株DNA,以DNA為模板,使用ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將菌株A15的ITS序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析(圖3),結(jié)果表明菌株A15與綠色木霉發(fā)育距離最近,其在同一分支內(nèi)。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和ITS序列比對(duì)分析,鑒定菌株A15為綠色木霉。

圖2 菌株A15的菌落特征及剛果紅透明圈示意圖Fig.2 Colony characteristics and schematic diagram of Congo red transparent circle of strain A15 A.菌落正面形態(tài);B.菌落反面形態(tài);C.孢子及菌絲形態(tài);D.菌株在剛果紅平板上的透明圈。A. Positive morphology of colony;B. Negative morphology of colony;C. Morphology of spores and hyphae;D. Transparent circle of strain on Congo red plate.

圖3 菌株A15的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of strain A15 參與比對(duì)序列的GenBank登錄號(hào)已列出。分支處標(biāo)注有自展值,0.005代表2個(gè)核苷的遺傳距離。The GenBank login number participating in the alignment sequence is listed. The branch is marked with a self-expanding value,0.005 represents the genetic distance of two nucleosides.

2.3 菌株A15降解油菜秸稈過程中組分變化分析

隨著菌株A15發(fā)酵油菜秸稈的時(shí)間增加,秸稈的失重率不斷增加,28 d時(shí)可達(dá)29.17%,且在發(fā)酵初期秸稈的降解速率明顯高于發(fā)酵后期。同時(shí),秸稈的纖維素含量和半纖維素含量分別下降至29.41%和17.18%,而木質(zhì)素的相對(duì)含量則略微上升至15.47%,表明菌株A15對(duì)纖維素及半纖維素均有良好的分解能力。伴隨著發(fā)酵過程的持續(xù),秸稈中總碳及水溶性氮的含量不斷下降,至發(fā)酵結(jié)束時(shí),總碳含量下降至456.16 g·kg-1,水溶性氮的含量下降至62.17 mg·L-1。而秸稈中總氮及水溶性碳的含量則先下降后上升,總氮含量在發(fā)酵7 d時(shí)達(dá)到最小值,為37.17 g·kg-1,發(fā)酵28 d時(shí)為40.91 g·kg-1,而水溶性碳含量在發(fā)酵7 d時(shí)達(dá)到最小值(460.89 mg·L-1),發(fā)酵28 d時(shí)增加至473.25 mg·L-1(表1)。

表1 菌株A15降解油菜秸稈過程中的組分變化Table 1 Changes of components during solid fermentation of rape straw by strain A15

2.4 菌株A15降解油菜秸稈過程中表面結(jié)構(gòu)的變化

從圖4可知:發(fā)酵1 d時(shí),秸稈木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)完整,表面平滑,僅出現(xiàn)少許細(xì)小圓形孔洞,菌絲開始附著在秸稈表面(圖4-B)。當(dāng)發(fā)酵14 d時(shí),秸稈表層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破裂,由初始的完整平滑狀態(tài)裂解為無定形松散狀態(tài),并伴隨出現(xiàn)大量不規(guī)則孔洞(圖4-C)。當(dāng)發(fā)酵28 d時(shí),秸稈結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,整體呈現(xiàn)出斷裂狀的碎片狀態(tài)且秸稈結(jié)構(gòu)變得更加纖細(xì)化,出現(xiàn)大量條狀裂紋,菌絲體侵入秸稈內(nèi)部,通過其分泌的水解酶系來有效降解秸稈的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)(圖4-D)。

圖4 菌株A15固體發(fā)酵油菜秸稈掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of solid fermentation of strain A15 A.菌株A15的菌絲及孢子囊;B、C、D分別為固體發(fā)酵1、14、28 d的油菜秸稈掃描電鏡圖像。A. Mycelium and sporangia of strain A15;B,C and D represent the scanning electron microscope image of rape straw on the 1,14 and 28 d of solid fermentation.

2.5 菌株A15盆栽模擬秸稈還田試驗(yàn)結(jié)果分析

分別于培養(yǎng)10、20和30 d取樣,油菜秸稈的形態(tài)變化如圖5所示。隨著菌株A15降解油菜秸稈的時(shí)間增加,秸稈的腐解程度不斷加劇。在初始狀態(tài)下,秸稈呈現(xiàn)亮黃色,質(zhì)地堅(jiān)硬,光澤度良好;伴隨包埋時(shí)間的推移,秸稈的顏色發(fā)生明顯變化,顏色由起初的亮黃色,不斷變深變黑逐漸失去光澤,同時(shí),秸稈的體積不斷縮小,硬度也持續(xù)下降,變得松散柔軟易碎;至30 d時(shí)秸稈失重率達(dá)57.50%,顯著高于不接菌對(duì)照組(43.88%)(表2)。表明菌株A15可有效降解油菜秸稈,具有良好的應(yīng)用前景。

圖5 盆栽模擬秸稈還田過程中油菜秸稈形態(tài)變化Fig.5 Morphological changes of rape straw during simulated straw returning in pot

表2 盆栽模擬秸稈還田過程中油菜秸稈的失重率Table 2 The weight loss rate of rape straw during simulated straw returning in pot

2.6 菌株A15纖維素酶基因celI的克隆與分析

菌株A15以油菜秸稈為唯一碳源生長的胞外酶譜分析顯示,左側(cè)活性染色膠圖中出現(xiàn)1條清晰透明條帶,其顯現(xiàn)出CMC酶活性,而右側(cè)考染膠圖中的條帶與左側(cè)具有酶活的條帶相互對(duì)應(yīng),因此,將對(duì)應(yīng)CMC酶活性的目的膠條切下進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)。

通過酶譜的質(zhì)譜檢測(cè),獲得1個(gè)纖維素酶氨基酸序列,其編碼基因(celI)序列分析顯示該基因全長1 374 bp,編碼457個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為47.405×103,理論等電點(diǎn)為5.06。利用NCBI的Conserved Domains對(duì)CelI的核苷酸序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),其含有1個(gè)CBH-EG保守結(jié)構(gòu)域,隸屬于GH7家族。利用SignalP-5.0 Server對(duì)CelI蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行分析,其信號(hào)肽為N端的24個(gè)氨基酸,推測(cè)該蛋白是一種胞外分泌蛋白。利用SWISS-MODEL對(duì)CelI進(jìn)行同源建模,預(yù)測(cè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。將CelI的氨基酸序列與PDB數(shù)據(jù)庫中已知結(jié)構(gòu)的蛋白進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示模板來源于Trichodermaharzianum(SMTL ID:5w0a.1.A),相似度為94.09%,可信度較高。CelI的結(jié)構(gòu)(圖6)為由多個(gè)loop區(qū)圍繞反向平行的β-折疊而形成的β-三明治結(jié)構(gòu),是GH7家族典型的蛋白結(jié)構(gòu)特征[19]。

圖6 CelI蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型Fig.6 Three dimensional structure prediction model of CelI protein

圖7 CelI蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of CelI protein M. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;1. pPICZαA空載轉(zhuǎn)化菌株胞外總蛋白;2. pPICZαA-celI轉(zhuǎn)化菌株胞外總蛋白;3. 純化后蛋白。M. The standard protein marker;1. Total extracellular protein of the pPICZαA transformed strain;2. Total extracellular protein of the pPICZαA-celI transformed strain;3. Purified protein.

2.7 纖維素酶CelI的異源表達(dá)與酶學(xué)特性分析

表達(dá)純化后的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為72×103(圖7),較預(yù)測(cè)值偏大,可能是重組蛋白糖基化所造成的。CelI包含一個(gè)CBH-EG保守結(jié)構(gòu)域,其同時(shí)能展現(xiàn)出內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的雙重活性。對(duì)纖維素酶CelI的酶學(xué)特性進(jìn)行探究,結(jié)果如圖8所示。纖維素酶活性隨著酶促反應(yīng)溫度的上升先升后降,在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值,溫度過低或過高均影響酶促反應(yīng)速率;在40、45 ℃條件下溫育8 h時(shí),重組纖維素酶活性保持較好,與初始值變化不大,當(dāng)溫育溫度大于50 ℃時(shí),隨著溫育時(shí)間的增加,酶活性均顯著下降;當(dāng)pH3時(shí),纖維素酶活性趨近于0,而CelI的內(nèi)切葡聚糖酶活性在pH4時(shí)達(dá)最大值,其外切葡聚糖酶活性在pH5時(shí)達(dá)最大值;Co2+、Mn2+、Ca2+均對(duì)CelI的內(nèi)切纖維素酶活性具有促進(jìn)作用,而對(duì)于外切纖維素酶活性來說,Mn2+具有顯著激活作用,Zn2+、Fe3+具有抑制作用。

圖8 不同條件下CelI酶活性的變化Fig.8 Changes of CelI enzyme activity under different conditions A. 溫度對(duì)CelI酶活性的影響;B. pH值對(duì)CelI酶活性的影響;C. 溫度對(duì)CelI穩(wěn)定性的影響;D. 不同金屬離子對(duì)CelI酶活性的影響。A. Effect of temperature on the activity of CelI;B. Effect of pH value on the activity of CelI;C. Effect of temperature on the stability of CelI;D. Effects of different metal ions on the activity of CelI.

3 討論

生物質(zhì)能源作為唯一一種含碳的可再生能源,在實(shí)現(xiàn)碳中和、碳達(dá)峰等方面具有重要地位,是傳統(tǒng)化石能源的極佳替代者。我國農(nóng)作物秸稈生物質(zhì)資源十分豐富,而中國作為油菜生產(chǎn)大國,其生產(chǎn)面積和產(chǎn)量均約占世界的1/3[12],江蘇省作為長江下游油菜優(yōu)勢(shì)種植區(qū),油菜秸稈年產(chǎn)量巨大。因此,大力推動(dòng)油菜秸稈的資源化綜合利用在實(shí)現(xiàn)江蘇省農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有重要戰(zhàn)略意義。

油菜秸稈的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分十分復(fù)雜,主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素交聯(lián)而成,共同構(gòu)成牢固的三維立體木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)。在自然環(huán)境中,微生物充當(dāng)分解者,通過分泌多種酶系來有效降解、利用秸稈生物質(zhì)資源。其中,真菌多產(chǎn)胞外酶,且產(chǎn)酶量大、產(chǎn)酶效率高、產(chǎn)酶種類多,而被認(rèn)為是秸稈纖維素類物質(zhì)的主要降解者,絲狀真菌則最具代表性。本研究從南京市腐爛油菜秸稈田取樣,在自然條件下篩選出更適合于降解油菜秸稈的菌株。通過前期一系列富集篩選試驗(yàn),得到一株高效油菜秸稈降解真菌TrichodermavirideA15,試驗(yàn)結(jié)果表明以油菜秸稈粉為底物,菌株A15可分泌大量纖維素酶至發(fā)酵培養(yǎng)基中。王金昌等[20]通過類似的方法從土壤中篩選出1株高效降解水稻秸稈的真菌草酸青霉(Penicilliumoxalicum)T1,其濾紙酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性和β-葡聚糖苷酶活性分別達(dá)30、78.68、22和39 U·mL-1。楊娜等[21]從自然發(fā)酵堆肥中篩選出1株纖維素降解真菌SC2,發(fā)酵10 d后其對(duì)玉米秸稈的降解率可達(dá)33.07%,經(jīng)鑒定為黑曲霉(Aspergillusniger)。本研究利用改進(jìn)后的范式洗滌法(Van Soest)對(duì)菌株A15固體發(fā)酵過程中油菜秸稈的木質(zhì)纖維素含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示隨著發(fā)酵進(jìn)程的持續(xù),秸稈中纖維素以及半纖維素含量均顯著降低,但木質(zhì)素含量則略有增加,原因是相較于纖維素及半纖維素來說,木質(zhì)素含量更低且更難被降解,其降解的程度和速度遠(yuǎn)不及前者,所以導(dǎo)致剩余物中木質(zhì)素的相對(duì)含量略有提升。Arantes等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

本研究通過纖維素酶酶譜分析及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)獲得GH7家族纖維素酶基因celI的序列信息,并利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了該基因在畢赤酵母中的異源表達(dá)。糖苷水解酶7家族(GH7)中的纖維素酶在絲狀真菌分解秸稈木質(zhì)纖維素中起著關(guān)鍵作用,并已成為工業(yè)纖維素分解過程中酶混合物的主要成分[23-24]。對(duì)CelI的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),其同時(shí)具有內(nèi)、外切葡聚糖酶活性的雙重功能,而“內(nèi)、外協(xié)同作用”對(duì)于纖維素的降解至關(guān)重要,其中內(nèi)切葡聚糖酶主要水解纖維素的無定形部分,將纖維素鏈截短并產(chǎn)生大量新的糖鏈末端,從而增加纖維二糖水解酶的鏈端可用性,進(jìn)而增加整體的降解效率[25]。CelI的內(nèi)、外切葡聚糖酶活性的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃,這與其他真菌纖維素酶[26]的最適溫度相似,但最適pH值略有不同。Pellegrini等[26]對(duì)Trichodermaharzianum的重組內(nèi)切葡聚糖酶Cel7B進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),其在55 ℃、pH3時(shí)顯示出最佳活性,而Colussi等[27]的研究發(fā)現(xiàn)Trichodermaharzianum的纖維二糖水解酶(ThCBHI)的最適溫度為50 ℃,最適pH值則為5。本研究中,CelI具有良好的熱穩(wěn)定性,將其置于50 ℃條件下保持8 h后仍具有約95%的內(nèi)切葡聚糖酶活性及62%的外切葡聚糖酶活性。綜上所述,本研究篩選獲得了高效油菜秸稈降解菌株,為后期菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)和菌劑制備奠定了基礎(chǔ)。