外源水楊酸對鋁脅迫下菊芋根系分泌物的影響

楊文敏, 嚴(yán)浙楠, 毛紀(jì)隆, 倪曉菁, 黃家妮, 潘蕾蕾, 張雅琦, 婁賽煒, 楊顏裴, 張麗宇, 劉 鵬

( 浙江師范大學(xué) 植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 金華 321004 )

紅壤作為我國南方的地帶性土壤，占近全國土地總面積的四分之一(陳永波和王成華，2001)。紅壤具有較低的pH(pH值為4～5.5)，其中有機(jī)質(zhì)和交換性鹽基離子較少，加上我國南方酸雨發(fā)生頻率高等原因，土壤酸化日益加重，活化了大量難溶性鋁(Liu et al., 2015)。土壤中可溶性鋁含量的增加顯著提高了富鋁化程度，對植物根系發(fā)育和水分、養(yǎng)分的吸收影響甚大，是目前公認(rèn)的制約酸性土壤作物生長的主要因素之一(王寧等，2011)。植物對鋁離子的耐受機(jī)制主要有兩種，即體外排斥機(jī)制和內(nèi)部耐受機(jī)制(李交昆和唐璐璐，2013)。其中植物根系分泌有機(jī)酸、酚類化合物、磷酸鹽等改變根系環(huán)境，將鋁離子螯合成無毒或毒性較小的化合物，增強(qiáng)植物內(nèi)部對鋁離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和耐受，降低鋁離子對植物體的危害(Zhang et al., 2019)。另外植物通過耐受基因的轉(zhuǎn)錄參與調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)1與1在調(diào)節(jié)植物對鋁離子耐受性上有重要作用(Ohyama et al., 2013)。轉(zhuǎn)錄因子46和5對耐鋁基因的調(diào)控方式與1和1調(diào)控方式不同，46參與滲透脅迫反應(yīng)和氣孔運(yùn)動的調(diào)節(jié)，5與1基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)1基因的表達(dá)，使水稻對鋁離子的耐受性增強(qiáng)(Ding et al., 2013; Arenhart et al., 2013; Arenhart et al., 2014)。

菊芋()又名洋姜、鬼子姜，菊科(Compositae)，向日葵屬(L.)，為多年生草本植物。該植物對各種生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng)，全球范圍內(nèi)種植廣泛(Wall et al., 1986; Wyse et al., 1986)。菊芋富含菊糖可作為生產(chǎn)乙醇、生物發(fā)酵及制取油脂的良好來源；作為藥用植物，具有清熱涼血和利水除濕等功效。為菊芋在南方種植的廣泛推廣，如何解決鋁脅迫對菊芋生長的影響成為亟待解決的問題，因此開展菊芋根系分泌物中有機(jī)酸及相關(guān)代謝酶活性測定有助于進(jìn)一步探清菊芋對鋁脅迫的響應(yīng)。

水楊酸(salicylic acid，SA)屬酚類化合物，在植物體內(nèi)廣泛存在，為應(yīng)對逆境的信號傳導(dǎo)分子，它通過誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白(PR)基因的表達(dá)來使系統(tǒng)獲得抗性(SAR)(Shiras et al., 1997)。許多研究表明其在緩解生物和非生物的脅迫下發(fā)揮重要作用，馬志博等(2020)發(fā)現(xiàn)外源SA可提高鹽脅迫下酸棗幼苗抗氧化能力，緩解鹽脅迫對酸棗的傷害，提高植株凈光合速率和生長量。曹林等(2015)探究得出鋁脅迫下菊芋通過外源SA提高抗氧化酶活性和光合作用效率，但菊芋根尖分泌的有機(jī)酸和氨基酸如何應(yīng)對鋁脅迫條件，外源SA又發(fā)揮了怎么樣的作用，這些問題值得探究。所以本文將對鋁脅迫條件下菊芋根系分泌物中檸檬酸、蘋果酸、草酸、脯氨酸、氨基酸以及根尖檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶進(jìn)行分析討論，以期為菊芋在紅壤酸鋁地區(qū)的安全種植與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取耐鋁性較強(qiáng)的南京菊芋和耐鋁性較弱的資陽菊芋作為本次試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

選取大小相同的菊芋塊莖進(jìn)行土培，放于光照培養(yǎng)箱中催芽(白天：30 ℃，90%相對濕度，60%光照，14 h；黑夜：26 ℃，80%相對濕度，0%光照，10 h)，待其地上部長到8 cm左右時，再選擇長勢大致相同的菊芋幼苗移入帶孔塑料盆中培養(yǎng)，每盆3株，每組設(shè)置3個重復(fù)。Al與完全營養(yǎng)液混合成等量處理液用來均勻噴灑至菊芋根系土壤，Al以AlCl·6HO形式提供，利用稀釋的HCl將處理液pH調(diào)節(jié)至4.5。每天對菊芋葉片正反兩面均勻噴灑等量SA溶液，處理7 d，進(jìn)行根系分泌物的收集。所用濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)所得，試驗(yàn)分組如表1所示。

表 1 試驗(yàn)處理分組情況Table 1 Grouping of experimental treatments

根系分泌物收集：挑選健康完整的菊芋根系用蒸餾水進(jìn)行沖洗3～4次，然后用濾紙將殘留水吸干，同一處理每三株菊芋幼苗放入裝有200 mL 0.5 mmol·LCaCl溶液的燒杯中，使根系完全浸入，用錫紙包裹燒杯底部避光，光照下收集6 h，取出用100 mL去離子水清洗根系，共得300 mL根系分泌物，之后在40 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下濃縮至25 mL，將濃縮液過0.45 μm水系濾膜后，保存至-20 ℃待用測定各項(xiàng)指標(biāo)。

粗酶液制?。悍Q取植物2 cm根尖0.1 g，置于4 ℃冰浴的研缽中以1 mL提取液研磨成勻漿，提取液包含100 mmol·LTris-HCl buffer (pH 8.0)，0.1% (V/V) Triton X-100 (曲拉通-100)，2% (W/V) PVP (聚乙烯基吡咯烷酮)，10 mmol·L異抗壞血酸，以冷凍離心機(jī)在4 ℃下15 000 r·min離心5 min，上清液用于酶活測定(Chen et al., 2009)。

1.3 指標(biāo)測定

采用酸性茚三酮顯色法測定脯氨酸含量(李小芳和張志良，2016)。采用高效液相色譜法(HPLC)測定檸檬酸、草酸、蘋果酸和氨基酸濃度(王玉云等，2011)。檸檬酸合酶活性測定：取20 μL粗酶提取液加入1 mL檸檬酸合酶反應(yīng)液 [100 mmol·LTris-HCl buffer (pH 8.0)，5 mmol·L氯化鎂，0.5 mmol·LDTNB，0.15 mmol·L乙酰輔酶 A，再加4 mmol·L草酰乙酸混合，DTNB 注意避光]。通過測定412 nm處吸光值變化率，每隔 30 s測定一次吸光度，記錄其變化，時間為3 min (Li et al., 2000)。蘋果酸脫氫酶活性測定：取20 μL 粗酶提取液加入1 mL蘋果酸合酶反應(yīng)液(100 mmol·LpH 8.0 Tris-HCl buffer，0.5 mmol·LEDTA-Na，0.2 mmol·LNADH，70 mmol·LKCl)，再加入1 mL 1 mmol·L草酰乙酸啟動反應(yīng)。混勻后立即計(jì)時，每隔30 s在340 nm下測定1次吸光度，共測3 min，以NADH的增加或減少作為評價標(biāo)準(zhǔn)(Johnson et al., 1994)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測定均設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件中的Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析，用Origin 8.5軟件制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中檸檬酸濃度的影響

從圖1可以看出，單鋁處理組(T1)中，南京菊芋根系分泌物的檸檬酸濃度顯著增加，提升了2.78倍(<0.05)，而資陽菊芋中檸檬酸濃度升高不明顯，只升高了14.78%(>0.05)，這顯示出2個菊芋品種經(jīng)鋁脅迫處理后根系分泌物中檸檬酸濃度響應(yīng)存在差異。2個品種的檸檬酸濃度都隨著SA濃度的增大而不斷升高，其中南京菊芋T4與T1相比，上升幅度達(dá)3.32倍(<0.05)，資陽菊芋T4與T1相比，上升幅度達(dá)6.63倍(<0.05)，說明SA能夠改變菊芋根系分泌物中檸檬酸濃度來應(yīng)對鋁的脅迫，而且對敏感型資陽菊芋的緩解效果更加明顯。

具體組別介紹見表1。大寫字母表示資陽菊芋同一指標(biāo)在不同處理之間的差異顯著，小寫字母表示南京菊芋同一指標(biāo)在不同處理之間的差異顯著(P <0.05)。測定值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。下同。See Table 1 for detailed groups introduction. Capital letters indicate that the same index of Ziyang Helianthus tuberosus has significant differences between different treatments, and lowercase letters indicate that the same index of Nanjing H. tuberosus has significant differences between different treatments(P<0.05). The measured value is expressed as The same below.圖 1 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中檸檬酸濃度的影響Fig. 1 Effects of exogenous SA on Helianthus tuberosus citric acid concentrations in root exudates under aluminum stress

2.2 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中草酸濃度的影響

從圖2可以看出，單鋁處理(T1)下顯著增加了菊芋根系分泌物中的草酸濃度(<0.05)。不同濃度的外源SA處理后，南京菊芋的草酸濃度隨著水楊酸濃度的不斷增大而升高，最大值出現(xiàn)在SA濃度為1 000 μmol·L(T4)時，相比T1增長了192.69%(<0.05)，而資陽菊芋中草酸含量在100 μmol·L外源SA處理(T3)時達(dá)到最大值，增加了2.44倍(<0.05)。1 000 μmol·L外源SA處理(T4)時其草酸含量顯著低于T1(<0.05)，這可能是由于SA濃度過高對菊芋根系分泌草酸產(chǎn)生抑制作用。

圖 2 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中草酸濃度的影響Fig. 2 Effects of exogenous SA on Helianthus tuberosus oxalic acid concentrations in root exudates under aluminum stress

2.3 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中蘋果酸濃度的影響

如圖3所示，單鋁處理(T1)時，南京菊芋和資陽菊芋根系分泌物中蘋果酸濃度與對照組(T0)相比并無明顯變化。外源SA處理后，南京菊芋在10 μmol·L的外源SA加入(T2)時達(dá)到最大值，蘋果酸濃度為T1時的2.15倍(<0.05)，資陽菊芋也在此濃度達(dá)到最大值，但上升程度不明顯(>0.05)。

圖 3 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中蘋果酸濃度的影響Fig. 3 Effects of exogenous SA on Helianthus tuberosus malic acid concentrations in root exudates under aluminum stress

2.4 外源SA對鋁脅迫下菊芋根尖檸檬酸合酶及蘋果酸脫氫酶活性的影響

由表2可知，在對照組(T0)中，南京菊芋根尖檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶活性都顯著低于資陽菊芋(<0.05)。在單鋁處理組(T1)中，菊芋根尖中檸檬酸合酶活性得到提升。10、100、1 000 μmol·LSA的加入可不同程度地提升菊芋根尖中檸檬酸合酶活性，但在資陽菊芋中僅高濃度SA(T4)處理后其活性發(fā)生明顯升高(<0.05)。南京菊芋在10 μmol·LSA加入(T2)時達(dá)到檸檬酸合酶活性最大值，與T1組相比上升了1.46倍(<0.05)。與單鋁處理組相比，不同濃度外源SA加入后對南京菊芋根尖中蘋果酸脫氫酶活性影響不大，但顯著降低了資陽菊芋根尖中蘋果酸脫氫酶活性，最低值(T4)與最高值(T1)相比下降53.19%(<0.05)。

表 2 外源SA對鋁脅迫下菊芋根尖蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶活性的影響Table 2 Effects of exogenous SA on Helianthus tuberosus malate dehydrogenase and citrate synthase activities in root tips under aluminum stress

2.5 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中脯氨酸含量的影響

如圖4所示，在單鋁脅迫T1組中，南京菊芋和資陽菊芋根系分泌物脯氨酸含量均顯著提升，分別升高了3.79%和3.08%(<0.05)。菊芋在加入不同濃度外源SA后，根系分泌物中脯氨酸含量與T1相比呈顯著性下降趨勢(<0.05)。南京菊芋在SA濃度100 μmol·L(T3)時下降最大，降低了5.11%(<0.05)，而資陽菊芋在SA濃度為1 000 μmol·L(T4)時脯氨酸含量下降了4.48%(<0.05)。

圖 4 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中脯氨酸含量的影響Fig. 4 Effects of exogenous SA on Helianthus tuberosus proline contents in root exudates under aluminum stress

2.6 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中氨基酸濃度的影響

如圖5所示，在單鋁處理組(T1)中，南京菊芋和資陽菊芋根系分泌物中總氨基酸濃度在鋁處理下均大幅度下降，可見500 μmol·L鋁離子濃度下氨基酸分泌會受阻，其中南京菊芋根系分泌物中氨基酸濃度降低顯著，下降了89.59%(<0.05)。南京菊芋的總氨基酸濃度在外源SA加入后呈現(xiàn)增加的趨勢，高濃度(1 000 μmol·L) SA的加入(T4)使南京菊芋根系分泌物中總氨基酸濃度升高顯著(<0.05)，資陽菊芋根系分泌物中總氨基酸濃度變化趨勢與南京菊芋相反，低濃度(10 μmol·L) SA(T2)使資陽菊芋根系分泌物中總氨基酸濃度顯著高于T1且達(dá)到緩解的最高水平(<0.05)。

圖 5 外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌物中氨基酸濃度的影響Fig. 5 Effects of exogenous SA on Helianthus tuberosus amino acid concentrations in root exudates under aluminum stress

3 討論與結(jié)論

曾有研究指出，在鋁脅迫下植物根系分泌的檸檬酸、草酸、蘋果酸等與鋁脅迫濃度顯著正相關(guān)(錢蓮文等，2018)。鋁脅迫處理對植物根系分泌檸檬酸的探究闡明，鋁脅迫會使大豆()(徐躍滋，2015)、栝樓()(高培培，2013)分泌的檸檬酸增多，我們的試驗(yàn)也檢測到了這一指標(biāo)的變化，并且發(fā)現(xiàn)若適當(dāng)增加SA含量，根系分泌物中有機(jī)酸及根尖相關(guān)代謝酶發(fā)生利于植物生長的變化。與單鋁組(T1)相比，當(dāng)施加10、100、1 000 μmol·LSA時，檸檬酸含量隨緩解濃度的升高呈顯著上升趨勢，這表明了外源SA調(diào)節(jié)了菊芋根系對檸檬酸的合成代謝。另外，在探究外源SA對鋁脅迫下菊芋根系分泌草酸含量的變化時，我們得到草酸在兩地菊芋中有不同的表現(xiàn)：耐鋁性強(qiáng)的南京菊芋隨外源SA的加入，其草酸分泌量不斷增加，并且隨濃度的增加而上升，而鋁敏感型的資陽菊芋卻呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，過高濃度的SA可能對菊芋耐鋁調(diào)節(jié)起不到正向作用，這與劉寧(2011)研究水楊酸對大豆耐鋁性調(diào)控機(jī)制的結(jié)論一致，其發(fā)現(xiàn)低濃度(10 μmol·L) SA處理大豆能顯著緩解Al對根伸長的抑制，降低Al在根尖中的積累，SA濃度過高不僅不能緩解鋁毒，反而還會造成雙重脅迫。因此，認(rèn)為單鋁脅迫下菊芋根系3種有機(jī)酸的迅速增加有利于減少鋁離子對根尖的傷害，外源施加的SA調(diào)節(jié)了菊芋根系有機(jī)酸及相關(guān)代謝酶對鋁脅迫的響應(yīng)，最終表現(xiàn)在植物體中有機(jī)酸不斷積累，以達(dá)到緩解鋁脅迫的目的，這與孔令楠(2013)所研究的鋁脅迫下過氧化氫對大豆耐鋁性調(diào)控及其與水楊酸信號互作關(guān)系結(jié)果一致。施加一定濃度外源SA后可緩解菊芋在鋁脅迫下造成的損害，它可能通過影響相應(yīng)酶對有機(jī)酸的分泌代謝產(chǎn)生作用，從而引起植株體內(nèi)有機(jī)酸濃度的變化，增強(qiáng)菊芋的耐鋁性。另外，Ma等(2001)發(fā)現(xiàn)耐鋁小麥在鋁脅迫下根尖分泌的蘋果酸比敏感品種多5～10倍。Ryan等(1995)通過對36個品種小麥進(jìn)行相同程度的鋁處理，證明了根尖有機(jī)酸分泌量與其耐鋁性呈正相關(guān)性。在2個菊芋品種對比中我們得到鋁脅迫下南京菊芋根尖有機(jī)酸分泌量均大于資陽菊芋，可知耐鋁性菊芋可分泌更多的有機(jī)酸來應(yīng)對不良條件。

檸檬酸合酶(CS)和蘋果酸脫氫酶(MDH)是與生物代謝相關(guān)的兩種關(guān)鍵酶(徐愛紅等，2020)，前者是調(diào)控三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)的第一步反應(yīng)，催化乙酰輔酶A和草酰乙酸形成檸檬酸，而后者可以催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆反應(yīng)，是TCA循環(huán)的重要酶之一。植物個體通過提高CS酶的表達(dá)量來應(yīng)對逆境條件(張寧寧，2012)，本研究結(jié)果顯示受鋁脅迫后菊芋根系檸檬酸合酶活性有增強(qiáng)變化。外源SA加入后2個菊芋品種的CS酶上升趨勢有所不同，南京菊芋需要的SA濃度遠(yuǎn)低于資陽菊芋，兩者的檸檬酸含量在CS酶的催化作用下總體呈現(xiàn)上升趨勢。蘋果酸脫氫酶基因的表達(dá)量可以提高植物的耐鋁能力(Tesfaye et al., 2001; Wang et al., 2010)，說明MDH活性的強(qiáng)弱直接影響植物的耐鋁性。通過探究我們發(fā)現(xiàn)鋁脅迫與外源SA的處理對資陽菊芋有較大的影響，鋁脅迫后其活性較之前有顯著性差異而對耐鋁性較強(qiáng)的南京菊芋沒有顯著的影響，可能是耐鋁能力強(qiáng)的南京菊芋在遭受鋁毒時，其MDH酶活性增強(qiáng)促使根系迅速分泌大量有機(jī)酸與Al產(chǎn)生螯合作用，提高了植物的耐鋁性。

氨基酸能夠提高植物對外界非生物脅迫的適應(yīng)性, 當(dāng)植物遇到外界脅迫條件時, 氨基酸主要通過參與改變植物體內(nèi)某些生理代謝, 或調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)和關(guān)鍵酶活性等方式來增強(qiáng)植物對各種逆境的適應(yīng)性反應(yīng)(宋奇超等，2012)。在單鋁脅迫時菊芋脯氨酸含量均顯著增加，這與王丹等(2011)的結(jié)縷草抗寒性研究結(jié)果一致，表明植物在逆境脅迫下可以通過增加脯氨酸含量來維持自身細(xì)胞內(nèi)外壓力平衡。當(dāng)外源SA加入后，脅迫程度得到一定的緩解，菊芋根系分泌的脯氨酸含量都有所下降，這在大豆試驗(yàn)中也得到證實(shí)(劉寧，2011)。鋁脅迫下菊芋根系分泌的總氨基酸濃度顯著下降，菊芋總氨基酸含量下降的原因之一可能是受到了高濃度的鋁脅迫，其根系遭到破壞，從而導(dǎo)致氨基酸分泌量下降；另一種原因可能是鋁脅迫對氨基酸內(nèi)部的不同成分有不同的影響，使細(xì)胞內(nèi)正常游離態(tài)氨基酸的數(shù)量產(chǎn)生變化，一部分氨基酸增加，另一部分氨基酸減少，總量呈現(xiàn)減少的趨勢。加入SA后氨基酸濃度有所上升，但仍達(dá)不到正常水平，所以認(rèn)為在500 μmol·L鋁脅迫下菊芋主要通過分泌有機(jī)酸減弱鋁對植物的危害。氨基酸濃度雖然在加入SA后有所上升，但依舊遠(yuǎn)小于3種有機(jī)酸，因此氨基酸更可能以營養(yǎng)作用為主，解毒只能起到輔助效果，這在鋁脅迫下常綠楊根系有機(jī)酸和氨基酸的分泌試驗(yàn)中得到了印證(錢蓮文等，2018)。

綜上所述，Al脅迫使菊芋根系分泌物中有機(jī)酸、氨基酸等指標(biāo)受到顯著影響。鋁能誘導(dǎo)菊芋根系分泌有機(jī)酸，有機(jī)酸的分泌與菊芋抗逆境響應(yīng)密切相關(guān)。施加外源SA后，資陽菊芋中草酸濃度顯示出“低促高抑”的效果，除此之外菊芋根系分泌物中檸檬酸、草酸、蘋果酸濃度與單鋁脅迫下相比有不同程度的增加，其中在南京菊芋組中表現(xiàn)更為明顯。在單鋁脅迫下，菊芋根系分泌的總氨基酸低于正常環(huán)境下的分泌量，外源SA加入后總體呈現(xiàn)上升趨勢。綜合評價認(rèn)為一定濃度外源SA加入后可通過根系分泌更多的有機(jī)酸緩解鋁脅迫，且在耐鋁性較強(qiáng)的南京菊芋中緩解效果更好。