三種氟苯尼考制劑溶出度測定和藥代動力學比較

Ke a npen，劉繼根，趙易藝，溫華鑫

（1.美國道勤生物科學，加州 弗里蒙特 94555；2.長沙道勤生物科技有限公司，湖南 長沙 410126）

氟苯尼考是在氯霉素與甲砜霉素的基礎(chǔ)上通過官能團的改變得到的，屬于氯霉素類動物專用的廣譜抗生素藥物[1-2]。其作用機制是在動物體內(nèi)可與細菌內(nèi)50S可逆性的亞基結(jié)合，阻止細菌酶的乙酰化作用，阻斷肽鏈延伸來抑制蛋白質(zhì)的合成，起到抑制細菌的作用[3-6]。它的抗菌活性優(yōu)于氯霉素和甲砜霉素，副作用極小，不會引起腎衰竭等嚴重問題且沒有再生障礙性貧血等不良反應(yīng)。主要用于牛、豬、雞和魚類的細菌性疾病[7]。但由于氟苯尼考溶解度極差，分散性差，且溶出慢，在吸收部位解離度小，進而導致氟苯尼考在生物體內(nèi)的生物利用度低，其在臨床上的應(yīng)用也受到了嚴重的限制[8-10]。為了解決提高氟苯尼考的水溶性的同時增加其藥物制劑的生物利用度的技術(shù)問題，美國道勤生物科學公司研發(fā)了星月制劑氟苯尼考,遮蔽了氟苯尼考的苦味并提高其水溶性，提高了藥物的生物利用度。本試驗通過星月尼考與普通水溶性氟苯尼考和普通不可溶性氟苯尼考兩種不同工藝制劑，在人工胃液和人工腸液中進行體外溶出度對比，以及對三種不同工藝藥物在豬體內(nèi)的藥代動力學特性進行分析，從而對星月制劑的工藝進行評價，以期為藥物合理使用以及企業(yè)的生產(chǎn)提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

乙酸乙酯（分析級）購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜級），購自天津市光復科技發(fā)展有限公司。氟苯尼考標準品（CAS：K0302010，規(guī)格100 mg，含量99.6%），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。20%氟苯尼考粉（星月制劑產(chǎn)品），由湖南道勤生物科技有限公司提供；20%氟苯尼考粉1（普通不水溶產(chǎn)品）、20%氟苯尼考粉2（普通水溶產(chǎn)品）均為市面上在售產(chǎn)品。

1.2 儀器

高效液相色譜儀：SHIMADZU LC-16，島津儀器（日本）有限公司；高速冷凍離心機：TGL-16，長沙湘儀儀器有限公司；水浴氮吹儀：μgC-24M，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；電子天平：SHIMADZU AUW120D，島津儀器（日本）有限公司；渦旋混合器：XW-30S，上海儀昕科學儀器有限公司；可調(diào)微量移液槍：Eppendorf5424。智能溶出儀：ZRS-8DS，博科科技有限公司；紫外分光光度計：756S，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 溶液配制

氟苯尼考標準儲備液(1mg/mL):精確稱取20mg氟苯尼考標準品置于20 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-20℃保存?zhèn)溆?。使用時配成不同濃度的氟苯尼考標準工作液，標準儲備液按乙腈∶水（3∶7)的溶液稀釋而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。

人工胃液：量取鹽酸16.4 mL到1L容量瓶中，加入800 mL水和胃蛋白酶10 g，溶解后搖勻，加水定容即得。

人工腸液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加入500mL水使其溶解，用0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，另取胰酶10g加水溶解，兩液混合后加水定容至1L即可。

1.4 試驗動物

選擇健康、體重相近的三元雜商品豬12頭(平均體重40.0±1.5 kg)，給藥前三天飼喂不含任何藥物的基礎(chǔ)日糧，自由飲水。在給予氟苯尼考粉之前10～12小時禁止給豬喂食，拌料給藥6h后自由采食和飲水。

2 分析方法

2.1 不同介質(zhì)體外溶出度比較

2.1.1 氟苯尼考標準曲線繪制

分別精密吸取標準品溶液（1mg/mL）0.5mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5mL、3 mL、3.5 mL于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，制成氟苯尼考濃度分別為50、100、150、200、250、300、350μg/mL的溶液。配置的人工胃液、人工腸液分別為空白對照，266nm波長處測吸光度，根據(jù)吸光度（A）為縱坐標，濃度（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸。得到標準曲線的線性回歸方程A=0.0027C+0.0064,R2=0.9986，氟苯尼考濃度為50～350μg/mL時，吸光度(A)與濃度(C)呈線性關(guān)系。

2.1.2 體外溶出度的測定

按2020年版《中國藥典》[11]關(guān)于溶出度與釋放度測定方法中的槳法進行測定，精密稱取3中不同工藝氟苯尼考粉約1g，置入溶出杯中，分別以已超聲脫氣的人工胃液、人工腸液900 mL為介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度(37.0±0.5)℃，從樣品進入介質(zhì)開始計時，分別于5、10、15、20、30、60、90 min定點取樣5mL，取樣后立即向溶出杯中補充相同溫度和體積的介質(zhì)，取出的樣品溶液在30 s內(nèi)用0.45μm的微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液（續(xù)濾液需要稀釋至濃度在標曲范圍內(nèi)）在266nm波長處測定吸收度A。將吸光值(A)代入標準曲線回歸方程，可計算得到各時間點的氟苯尼考累積溶出百分率(%)。計算累積溶出=An+(An+An-1+……+A2+A1)×V1/V2，式中An為某個時間點的溶出率，V1為各時間點固定取樣體積，V2為溶出介質(zhì)體積[12]。

2.2 藥代動力學比較

2.2.1 給藥方法及采血時間

試驗豬隨機分成3組，公母各半,每組4個重復，分別為星月制劑氟苯尼考A組、普通不水溶氟苯尼考粉B組、普通水溶性氟苯尼考粉C組。各試驗組在基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上分別添加每頭豬單劑量為20 mg·kg-1（以氟苯尼考計）的不同制劑的氟苯尼考粉。給藥前（0h）耳下靜脈采血約5mL作為空白對照。拌料給藥后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、36h各采血1次，每次采血約5mL。將其置于含肝素的離心管中，4000 r/min離心10 min，分離上清血漿，分裝并標記后置于-20℃凍存待測。

2.2.2 樣品處理

取血漿樣品0.5mL置于10mL離心管中，加1.5mL乙酸乙酯，渦旋混合5min，4000r/min離心10min，取上層乙酸乙酯上清液，重復提取一次，合并兩次乙酸乙酯提取液，氮氣吹干，殘留物用0.25mL的流動相溶解，渦旋混合5min，12000r/min離心5min，過0.45μm濾膜，上樣進行測定。

2.3.3 儀器條件

液相色譜條件：流動相：水∶乙腈（68∶32，V/V）；色譜柱：SHIMADZUETA-16C C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：30℃；進樣體積：20μL；檢測波長：224nm；流速：1.0mL/min。

標準工作曲線：用流動相將儲備液稀釋成0.025、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10μg/mL的標準工作溶液，按照樣品處理方法處理，取20μL進行HPLC測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

選用WinNonlin5.2.1藥物代謝動力學軟件，非房室模型處理不同氟苯尼考在豬體內(nèi)的“血藥濃度—時間”數(shù)據(jù)，利用SPSS統(tǒng)計軟件進行藥動學參數(shù)方差分析比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同介質(zhì)體外溶出度

三種不同工藝氟苯尼考粉在不同介質(zhì)中的體外溶出曲線如圖1、圖2所示。由圖1可知，在人工胃液中，三種氟苯尼考制劑以普通水溶性的氟苯尼考粉的終溶解度最高，30 min時星月尼考溶出度為56.05%，小于普通水溶性氟苯尼考（72.19%）、大于普通不水溶性氟苯尼考（33.64%）；通過圖2可知，與水溶性和不水溶性氟苯尼考相比，星月制劑工藝氟苯尼考在人工腸液中的溶出度和溶出速度大大提高，在5min時普通水溶性和不水溶性氟苯尼考的累計溶出度分別為93.5%和3.3%，而星月尼考的溶出度高達52.34%。溶出時間30 min時，星月尼考的溶出度達到了94.88%，水溶性氟苯尼考和不水溶性氟苯尼考溶出度分別為85.61%和38.83%。根據(jù)Noyes-Whitney溶出理論及生物利用度相關(guān)公式，可預測星月尼考的生物利用度增大，為后續(xù)生物利用度研究提供了理論基礎(chǔ)。

圖1 三種氟苯尼考粉在人工胃液中的體外溶出曲線

圖2 三種氟苯尼考粉在人工腸液中的體外溶出曲線

3.2 血漿中藥物濃度

豬服用星月制劑氟苯尼考粉、普通不水溶氟苯尼考預混劑1和普通水溶氟苯尼考預混劑2后各采血點血藥濃度見表1；服用星月制劑氟苯尼考粉、普通不水溶氟苯尼考預混劑1和普通水溶氟苯尼考預混劑2后各血藥濃度-時間曲線見圖3。

圖3 3種不同工藝氟苯尼考制劑在豬體內(nèi)的藥-時曲線

表1 口服氟苯尼考預混劑后的氟苯尼考在豬體內(nèi)的平均血藥濃度

3.3 主要藥代動力學參數(shù)

由表2可知，星月尼考、普通不水溶氟苯尼考、普通水溶氟苯尼考的藥峰濃度分別為8.05μg/L、7.36μg/L和7.58μg/L，達峰時間分別為：4.0h、1.68h和1.57h，計算得到的藥時曲線下面積（AUC）分別為59.87h·μg/mL、37.31h·μg/mL和42.29h·μg/mL。比較可看出，拌料飼喂不同工藝的氟苯尼考粉后，星月尼考達到血藥峰濃度的時間較晚，但其藥峰濃度分別是不水溶氟苯尼考、水溶的氟苯尼考的1.09和1.06倍，藥時曲線下面積分別是不水溶氟苯尼考、水溶的氟苯尼考的1.60和1.42倍。表明星月制劑工藝使氟苯尼考具有緩釋作用，吸收稍慢但相對充分，拌料飼喂星月尼考藥峰濃度更高，藥時曲線下面積更大，消除更緩慢，發(fā)揮作用的時效更長。

表2 3種不同工藝氟苯尼考粉在豬體內(nèi)的主要藥動學參數(shù)

4 結(jié)論

本試驗?zāi)M藥物在體內(nèi)胃腸道中的不同運轉(zhuǎn)狀態(tài)，比較了不同pH值條件下不同工藝氟苯尼考粉的溶出行為，對3種不同工藝氟苯尼考制劑的溶出度情況進行評估。測定其在人工胃液、人工腸液中的溶出情況，通過分析發(fā)現(xiàn)，星月尼考在腸道內(nèi)的溶出度較胃液中高，說明在腸道內(nèi)星月尼考更有利于吸收。星月工藝制劑使藥物在腸道環(huán)境中呈現(xiàn)親腸黏膜易吸收狀態(tài)，在胃液環(huán)境中呈現(xiàn)疏胃液和胃黏膜的聚合狀態(tài)，因而全面導入星月制劑工藝的星月尼考與普通氟苯尼考相比較，毒副作用更小，吸收利用率更高。該工藝不僅有效增大了溶解度，提高了藥物生物利用度，在臨床使用中具有很強的優(yōu)勢，對降低成本，提高藥效具有長遠的意義。