山羊巴貝斯蟲(chóng)病的診斷與防治

米慶良，周玉林

（1.湖南省懷化市中方縣蒿吉坪瑤族鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心畜牧站，湖南 懷化 418000；2.懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 懷化 418000）

羊巴貝斯蟲(chóng)病，又名焦蟲(chóng)病[1]，是由經(jīng)蜱傳播的巴貝斯蟲(chóng)寄生于紅細(xì)胞內(nèi)所引起的一種以精神沉郁、貧血、發(fā)熱、血小板減少為病理特征的血液源性寄生蟲(chóng)病[2-3]。該病的發(fā)病率及死亡率較高，且大多呈急性病例[4]。各個(gè)年齡段的山羊均可感染巴貝斯蟲(chóng)病，但幼、青齡山羊的發(fā)病率及病死率較成年山羊的高[5]。山羊在感染該病后，臨床上多出現(xiàn)高熱不退、精神不振、食欲廢絕、體格消瘦、不愿走動(dòng)、呼吸急促、嚴(yán)重貧血、粘膜黃疸及排血紅蛋白尿等一系列臨床癥狀[6]，多因救治不及時(shí)而死亡。此外，巴貝斯蟲(chóng)病呈世界性分布[7]，可在不同動(dòng)物之間相互傳播，且其流行具有一定的季節(jié)性[8]，對(duì)人和動(dòng)物的健康形成一個(gè)巨大潛在的威脅，也在一定程度上阻礙了全球養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 發(fā)病情況

2020年8月13日，湖南省懷化市中方縣某養(yǎng)殖戶于山林放養(yǎng)山羊268頭。最近，該養(yǎng)殖戶反應(yīng)在其所放養(yǎng)的山羊中，6頭青幼齡山羊出現(xiàn)了異常狀況。6頭發(fā)病山羊均出現(xiàn)高熱不退、精神不振、食欲廢絕、體格消瘦、不愿走動(dòng)、呼吸急促、嚴(yán)重貧血、粘膜發(fā)黃及腹瀉等一系列臨床癥狀；個(gè)別山羊出現(xiàn)血尿等臨床癥狀。該養(yǎng)殖戶一直認(rèn)為是細(xì)菌所引起的疾病，曾使用阿莫西林、恩諾沙星等抗生素進(jìn)行治療，但病情未得控制反而愈加嚴(yán)重。

2 臨床癥狀

發(fā)病羊只精神萎靡、體格消瘦、四肢無(wú)力，喜臥，被毛粗亂且無(wú)光澤，可視黏膜蒼白、黃染且回血緩慢，體溫41℃，呼吸急促（100～160次/min），心跳頻率明顯加快（102～189次/min），眼角有大量分泌物，并表現(xiàn)出特征性臨床癥狀——血尿及帶有惡臭味的褐色稀便；腹部觸診脾腫大、腎腫大且疼痛。此外，在發(fā)病羊只的體表見(jiàn)到大量吸飽血的蜱蟲(chóng)。

3 診斷

3.1 初步診斷

根據(jù)發(fā)病季節(jié)、發(fā)病羊只所表現(xiàn)出來(lái)典型的臨床癥狀及其體表的蜱蟲(chóng)和筆者臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，初步診斷該病為山羊的巴貝斯蟲(chóng)病。

3.2 染色鏡檢

頸靜脈采血于裝有抗凝劑的采血管中。用膠頭滴管吸取一滴血液于載玻片上，進(jìn)行瑞氏—姬姆薩氏染色，制作血涂片。染色步驟為：首先，用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋；待稍等片刻后，再滴加姬姆薩染液2～3滴；再稍等1～2分鐘后，再往玻片上滴加磷酸鹽緩沖液，直至膜面上染色液形成表面張力而終止滴加染色液；于室溫下，靜置染色30～40分鐘；最后，用自來(lái)水緩慢沖洗玻片3～5分鐘,晾干，置于顯微鏡下以進(jìn)行病原體形態(tài)學(xué)檢查。鏡檢結(jié)果顯示：病羊的紅細(xì)胞腫大呈球形，且內(nèi)含有藍(lán)色逗點(diǎn)狀的蟲(chóng)體（圖1）。根據(jù)鏡檢結(jié)果可初步確定該病的病原體為巴貝斯蟲(chóng)，該病為巴貝斯蟲(chóng)病。

圖1 巴貝斯蟲(chóng)的鏡檢圖Fig.1 Microscopic examination of Babesia

3.3 分子生物學(xué)診斷

將剩下的血液置于冰盒內(nèi)，拿回進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。用血液、組織DNA提取試劑盒（購(gòu)買(mǎi)于北京天根生化科技有限公司）提取血液的總DNA。將提取的好的DNA樣品，置于-20℃保存，備用。

利用引物18S rDNA-F（GAAACTGCGAATGGCT CA），18S rDNA-R（TGCTGTAGT-ATTCAAGGCGA）對(duì)巴貝斯蟲(chóng)核糖體18S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50uL，反應(yīng)條件為：95℃（預(yù)熱），5 min；95℃（變性），30 s；54℃（退火），30 s；72℃（延伸），1 min；共35個(gè)循環(huán)；最后72℃（延伸），5 min。反應(yīng)完成后，吸取5uLPCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示為陽(yáng)性，條帶單一、清晰，大小約為650 bp（圖2）。將PCR產(chǎn)物發(fā)送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖2 巴貝斯蟲(chóng)18S rDNA基因的PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of 18SrDNAgene of Babesia

將所獲得的序列在GenBank上進(jìn)行BLAST搜索分析，發(fā)現(xiàn)與已公布巴貝斯蟲(chóng)ITS2基因序列的相似度為99%～100%（圖3），從而確定該病原體為巴貝斯蟲(chóng)，該病為山羊的巴貝斯蟲(chóng)病。

圖3 巴貝斯蟲(chóng)18S rDNA基因的BLAST分析結(jié)果Fig.3 BLAST analysis results of 18SrDNAgene of Babesia

4 治療

根據(jù)確診結(jié)果，采用貝尼爾+輔助治療對(duì)發(fā)病羊只進(jìn)行治療。首先，靜脈注射50毫升含有頭孢噻呋鈉的0.9%氯化鈉溶液，1次/天，連用5天[9]；然后，再靜脈注射50毫升加有維生素B6、止血敏及維生素C等藥物的5%葡萄糖溶液，1次/天，連用5天[10]；最后在臨床癥狀得到緩解時(shí)，肌肉注射貝尼爾，劑量為4.5mg/kg；兩天一次，連用三次[11]。此外，靜脈注射加有茵梔黃的氨基30毫升，1次/天，連用5天[9]。一周后病羊恢復(fù)健康，再次進(jìn)行血涂片檢查，沒(méi)發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體。

5 預(yù)防措施

5.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖戶在飼喂過(guò)程中應(yīng)注意山羊的飼料，應(yīng)特別注重粗飼料與精飼料的搭配，盡量使?fàn)I養(yǎng)分配均衡。此外，可適當(dāng)?shù)卦陲暳现刑砑右恍┥窖蛏L(zhǎng)發(fā)育所必需的維生素、礦物質(zhì)及微量元素，以期提高山羊的身體素質(zhì)，增強(qiáng)其對(duì)疾病的抵抗力。

5.2 改善衛(wèi)生條件

及時(shí)清掃羊圈，確保羊圈干凈衛(wèi)生及通風(fēng)良好。不定時(shí)用雙甲脒乳油劑100倍稀釋液對(duì)羊圈及周?chē)鷧^(qū)域進(jìn)行噴灑[12]。羊糞要置于一偏僻且低洼處進(jìn)行堆積發(fā)酵。

5.3 切斷傳播途徑

蜱蟲(chóng)為巴貝斯蟲(chóng)的主要貯存宿主和傳播媒介，故避免蜱蟲(chóng)叮咬是預(yù)防山羊巴貝斯蟲(chóng)病的關(guān)鍵及根本途徑。盡量不到有蜱活動(dòng)的草場(chǎng)放牧，并對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)牟輩策M(jìn)行鏟除，且每天用3%火堿液進(jìn)行消毒1次[3]。羊群回圈應(yīng)進(jìn)行藥浴，一旦發(fā)現(xiàn)立即摘除，并用相應(yīng)的藥物加以預(yù)防和治療[13]。此外，對(duì)病死羊進(jìn)行深埋等無(wú)害化處理。

5.4 防止復(fù)發(fā)

在病羊治愈后1周內(nèi)，應(yīng)再次進(jìn)行血涂片檢查，以防止蟲(chóng)體未被全部清除而復(fù)發(fā)[14]。

6 討論

羊巴貝斯蟲(chóng)病主要是由蜱傳播的巴貝斯蟲(chóng)寄生于紅細(xì)胞內(nèi)所引起的一種以精神沉郁、貧血、發(fā)熱、血小板減少為病理特征的血液原蟲(chóng)病[2-3]。該病的發(fā)病率及死亡率較高，且各個(gè)年齡段的山羊均可感染巴貝斯蟲(chóng)病，但幼、青齡山羊的發(fā)病率及病死率較成年山羊的高[5]。山羊在感染該病后，臨床上多出現(xiàn)高熱不退、精神不振、食欲廢絕、體格消瘦、不愿走動(dòng)、呼吸急促、嚴(yán)重貧血、粘膜黃疸及排血紅蛋白尿等一系列臨床癥狀[6]，多因救治不及時(shí)而死亡。該病常發(fā)生于我國(guó)的多山林地帶[15]，且多流行于夏秋兩季，呈季節(jié)性流行[8]，故避免蜱蟲(chóng)叮咬是預(yù)防巴貝斯蟲(chóng)病的關(guān)鍵及根本途徑。然而，該病在發(fā)病之初常常不出現(xiàn)任何的臨床癥狀，容易被養(yǎng)殖者忽視，直到發(fā)病嚴(yán)重時(shí)才有明顯的臨床癥狀，但往往多為危重病例，且其所表現(xiàn)的癥狀也多與某些傳染病的癥狀相似，無(wú)豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的人難以區(qū)分，容易將其相互混淆或誤診。而傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)操作過(guò)于繁瑣、費(fèi)時(shí)，診治極為不便。利用分子技術(shù)檢測(cè)不僅操作簡(jiǎn)單，而且也大大提高了檢測(cè)結(jié)果的精確性，為養(yǎng)殖戶對(duì)該病的診斷和治療提供了便捷有效的途徑。因此，本文所采用的診斷和防治方法，也為以后的臨床診療提供技術(shù)參考。