他克莫司對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化的影響

鄭小菲，袁 泉，朱娟芳，秦帥華，趙紅宇

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學中心 鄭州 450052 2)四川大學華西口腔醫(yī)院種植科 成都 610041

隨著醫(yī)學進步，近幾十年來器官移植得到蓬勃發(fā)展，已成為治療肝腎等器官終末期疾病的最有效手段[1]。隨著器官移植患者壽命的延長，越來越多的免疫抑制劑使用者可能會面臨牙齒缺失而需要修復的問題。種植修復是解決缺牙問題的最佳治療方案。然而，有關(guān)免疫抑制劑使用人群能否進行牙種植治療一直存在爭議。他克莫司是從鏈霉菌屬中分離的一種新型強力免疫抑制劑，其免疫抑制效應(yīng)是傳統(tǒng)免疫抑制劑環(huán)孢素A的10～100倍[2],其引起高血壓和高脂血癥的副作用相對更小，肝毒性更低[3]，對腎功能無影響[4]。鑒于以上優(yōu)勢，他克莫司已逐漸取代環(huán)孢素A成為肝臟、腎臟等器官移植患者的首選免疫抑制劑[5]。臨床研究和動物研究[6-8]顯示，他克莫司作用后骨量減少、骨礦化密度降低，導致骨質(zhì)疏松。另有研究[9]表明，他克莫司抑制小鼠體內(nèi)鈦種植體的骨結(jié)合。但是他克莫司影響骨形成和骨吸收的具體機制尚不明確。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)具有多潛能干性，能分化為成骨細胞[10]。本研究觀察了他克莫司對BMSC增殖和成骨分化的影響，以期為免疫抑制劑使用者進行牙種植治療提供臨床指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物他克莫司、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、茜素紅購自美國Sigma公司，α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒、總RNA提取試劑盒購自日本TaKaRa公司，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。6～8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠購自成都市達碩實驗動物有限公司。

1.2 小鼠BMSC的分離培養(yǎng)用12.5 g/L三溴乙醇過量麻醉處死小鼠，浸泡于體積分數(shù)75%乙醇中消毒3 min。剪開小鼠雙側(cè)后肢皮膚，完整取出股骨和脛骨，用含體積分數(shù)5%青鏈霉素雙抗的PBS沖洗；將股骨和脛骨轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中，剔除附著的肌肉和筋膜組織，PBS洗滌2次；剪開股骨和脛骨一端，插入1 mL沖洗針用培養(yǎng)基沖出骨髓，反復沖洗直至骨干發(fā)白，然后用5 mL含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中放置于體積分數(shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后換液除去未貼壁細胞，之后根據(jù)細胞生長狀況，每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，鏡下可見培養(yǎng)至第7天時細胞完全伸展，呈長梭形,為BMSC。待細胞密度達到90%融合時，吸出培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入少量0.5 g/L胰蛋白酶(含EDTA)進行消化，1∶2比例傳代。

1.3 實驗分組將他克莫司粉劑溶于二甲基亞砜，無菌濾器過濾，分裝于EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂脮r用培養(yǎng)基稀釋至最終工作濃度(50、500 nmol/L)。

取第3代小鼠BMSC，接種于細胞培養(yǎng)板中，24 h后觀察細胞貼壁情況，若細胞貼壁良好則更換為成骨誘導培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C的α-MEM培養(yǎng)基)。低、高劑量他克莫司組成骨誘導培養(yǎng)基中分別添加終濃度為50、500 nmol/L的他克莫司，空白對照組不加他克莫司。每3 d更換成骨誘導培養(yǎng)基。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖將BMSC制備成5×104個/mL的單細胞懸液，取100 μL接種于96孔板，24 h細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，按1.3分組更換為含0、50、500 nmol/L他克莫司的成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d進行CCK-8檢測。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃條件下孵育2 h，于450 nm處測定光密度(optical density，OD)值。實驗重復3次。

1.5 BMSC中成骨分化相關(guān)標志物mRNA的檢測將BMSC以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，按1.3分組更換為相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)5、10 d。收集細胞，采用qRT-PCR檢測成骨分化相關(guān)標志物Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)、Alp、骨鈣蛋白(Ocn) mRNA的表達水平。引物序列見表1。提取總RNA，測定RNA濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，Rox 參比染劑0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，用無核酸酶水補充至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算目的mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

表1 引物序列

1.6 BMSC成骨分化能力的測定BMSC按1.3分組處理10 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min。PBS再次洗滌2次，每次2 min。按照ALP染色試劑盒說明進行ALP染色。采用定量試劑盒檢測ALP活性：按試劑盒指示配制蛋白標準品及BCA工作液，使用酶標儀于562 nm處測定OD值，然后根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算樣品中ALP的活性。實驗重復3次。

細胞分組培養(yǎng)14 d后，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每次5 min；體積分數(shù)95%乙醇固定20 min；蒸餾水清洗2次；加入10 g/L茜素紅染液(pH 4.2)，37 ℃染色5 min；蒸餾水清洗2次。大體觀察染色情況，并在倒置相差顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)。收集鈣化結(jié)節(jié)，用100 g/L氯化十六烷基吡啶孵育1 h，在562 nm波長處測OD值。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組細胞增殖能力、成骨分化標志物mRNA的表達水平和成骨分化能力，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞增殖能力比較與空白對照組(0.60±0.09)比較，低、高劑量他克莫司組細胞增殖能力均升高[OD值分別為(1.25±0.10)、(1.32±0.12)，3組比較，F(xiàn)=14.406，P=0.005]，表明他克莫司可促進BMSC增殖。

2.2 3組細胞成骨分化標志物mRNA表達水平的比較見表2。培養(yǎng)5 d，與空白對照組比較，除Ocn外，低、高劑量他克莫司組細胞中各成骨分化標志物mRNA的表達水平均有不同程度的升高，除Alp外，無明顯的劑量依賴性。培養(yǎng)10 d，低、高劑量他克莫司組Osterix和Ocn mRNA的表達水平升高。

表2 各組細胞Runx2、Osterix、Alp和Ocn mRNA表達水平的比較(n=3)

2.3 3組細胞成骨分化能力比較低、高劑量他克莫司組ALP染色較空白對照組加深(圖1上排)?？瞻讓φ战M和低、高劑量他克莫司組均可見鈣化結(jié)節(jié)，低、高劑量他克莫司組鈣化結(jié)節(jié)更多(圖1下排)。定量結(jié)果見表3。與空白對照組比較，低、高劑量他克莫司組ALP活性增強，鈣化結(jié)節(jié)增多，但2組間差異無統(tǒng)計學意義。

1～3：分別為空白對照組、低劑量他克莫司組、高劑量他克莫司組

表3 各組細胞ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)的比較(n=3)

3 討論

免疫抑制劑使用者會面臨牙齒缺失修復的問題。在理想條件下，種植修復是替代缺失牙的最佳治療方案。免疫抑制劑在發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的同時可能影響骨改建和骨愈合。因此，免疫抑制劑使用者的牙種植問題引起了口腔種植醫(yī)生的關(guān)注和重視，探索其具體作用機制具有重要意義。

骨代謝包括成骨細胞的骨生成和破骨細胞的骨吸收，二者維持骨生態(tài)的穩(wěn)定。BMSC作為多潛能干細胞在合適條件下可以分化為成骨細胞；在體外培養(yǎng)時BMSC能夠快速增殖，不喪失其干性特征，是組織工程等研究中的常用細胞[11]。因此本研究對小鼠BMSC進行成骨誘導，觀察他克莫司對BMSC增殖和成骨分化的影響，旨在從細胞水平揭示他克莫司體內(nèi)影響種植體骨結(jié)合原因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，他克莫司作用下BMSC增殖能力強于空白對照組。Byun等[12]學者評價環(huán)孢素A和他克莫司兩種免疫抑制劑對大鼠間充質(zhì)干細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，他克莫司可促進大鼠間充質(zhì)干細胞的體外增殖，本研究結(jié)果與其相一致。

Runx2和Osterix是成骨分化過程中必需的轉(zhuǎn)錄因子，在成骨分化的早期進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13-14]。ALP是成骨分化過程中的早期標志物，其表達水平與成骨細胞分化成熟程度呈正相關(guān)[15]。OCN是成骨分化的中晚期標志物，主要由成熟的成骨細胞分泌合成，參與骨礦化過程，在骨礦化階段其表達量增多[16]。本實驗qRT-PCR結(jié)果顯示，他克莫司作用5 d后，相比空白對照組，BMSC中Runx2、Osterix、Alp mRNA的表達水平上調(diào)；3組間Ocn基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義，推測原因可能為分化早期Ocn分泌量較少。10 d后，3組Runx2和Alp mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義；兩他克莫司組Osterix mRNA表達水平仍高于空白對照組；3組Ocn mRNA的表達水平均有所上調(diào)，兩他克莫司組的表達量高于空白對照組。培養(yǎng)14 d后茜素紅染色結(jié)果顯示，他克莫司組鈣化結(jié)節(jié)增加，ALP活性增強。有研究[17]表明，他克莫司促進牙齦來源間充質(zhì)干細胞的成骨分化，本研究結(jié)果與其一致。在成骨分化早、中、晚期，他克莫司均可促進BMSC成骨分化。

綜上，本研究結(jié)果表明，他克莫司在體外可促進小鼠BMSC的增殖和成骨分化。先前研究表明他克莫司在體內(nèi)抑制骨愈合，其原因可能由于他克莫司對破骨細胞的促進作用明顯強于成骨作用或者由于其他間接因素的調(diào)控，具體機制有待進一步研究。