牛膝-續(xù)斷治療股骨頭壞死的作用機(jī)制*

李金宗，侯德才，鞏雪

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 遼寧沈陽(yáng) 110032 2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 遼寧沈陽(yáng) 110032

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the Femoral Head，ONFH）為難治性疾病，因其高度致殘性之因引發(fā)越來(lái)越多的人群關(guān)注[1]。對(duì)于本病，保髖治療作為一種重要治療方法一直以來(lái)備受青睞[2]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有言：“不治已病治未病?！敝嗅t(yī)藥向來(lái)遵循整體觀念和辨證論治這個(gè)基本出發(fā)點(diǎn)，對(duì)方藥和疾病的關(guān)系研究較少，因而探尋其藥物應(yīng)用在本病中存在重要研究?jī)r(jià)值。如今，隨著中醫(yī)藥的日益發(fā)展，通過(guò)數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)在系統(tǒng)生物學(xué)的理論基礎(chǔ)上，聚焦所需要研究的蛋白、基因和通路，能夠更加準(zhǔn)確合理地指導(dǎo)中藥在臨床治療中的運(yùn)用[3]。并且“牛膝—續(xù)斷”作為活血化瘀法治療股骨頭壞死的常用藥物[4]，牛膝是莧科植物川牛膝的干燥根，產(chǎn)自四川。味苦、甘、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)。牛膝味苦泄降，“走而能補(bǔ)，性善下行”，在活血化瘀的同時(shí)能通利關(guān)節(jié)、引血下行，而善治下焦瘀血證[5]。而續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，續(xù)折傷的功效[6]。故而運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探尋其蛋白靶點(diǎn)效應(yīng)關(guān)系及對(duì)股骨頭壞死治療作用機(jī)制有重要研究?jī)r(jià)值。故而采用此方法以達(dá)到探尋及了解其藥物成分與疾病靶點(diǎn)之間的具體關(guān)系預(yù)測(cè)，從而為進(jìn)一步臨床觀察研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供具體方向性指導(dǎo)。

資料與方法

1 活性成分及靶點(diǎn)篩選

以“牛膝”“續(xù)斷”為關(guān)鍵詞，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/index.php） 的ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）功能，以口服生物利用度OB大于30%、類(lèi)藥性DL＞0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得活性成分，并預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)信息。通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.u-niprot.org/）搜索靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的人類(lèi)基因，進(jìn)行信息匯總。

2 檢索已知的股骨頭壞死靶點(diǎn)

在GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards.org/）中，以“ANFH”“AVN”“ONFH”“osteonecrosis of the femoral head”及“femoral head necrosis”為搜索詞，檢索出與股骨頭壞死相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

3 篩選藥物-疾病共同靶點(diǎn)

利用R 語(yǔ)言4.1.2 獲得牛膝-續(xù)斷與股骨頭壞死共同靶點(diǎn)，于Venny2.1 在線平臺(tái)構(gòu)建韋恩圖進(jìn)行可 視化。

4 牛膝-續(xù)斷治療股骨頭壞死的蛋白間相互作用

使 用String 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//cn.string-db.org/）PPI 分析功能處理共同靶點(diǎn)，選擇物種為“人類(lèi)”、置信度＞0.4，隱藏離散點(diǎn)，其余設(shè)置默認(rèn)，獲得可以展示蛋白相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)，從而明確牛膝-續(xù)斷藥對(duì)與股骨頭壞死共同靶點(diǎn)蛋白間的相互作用。運(yùn)用Cytoscape3.8.2 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行美化，并且篩選出核心靶點(diǎn)。

5 共同靶點(diǎn)GO 及KEGG 富集分析

利用R 語(yǔ)言4.1.2 及org.Hs.eg.db 等相關(guān)程序包，對(duì)潛在共同靶點(diǎn)的生物過(guò)程（bio-logical process）、細(xì) 胞 組 分（cell component）、分 子 功 能（molecular function）這3 個(gè)方面分別富集分析，選擇每項(xiàng)前10繪制可視化柱狀圖。選擇KEGG 富集分析前20 條進(jìn)行可視化。從而探究牛膝-續(xù)斷藥對(duì)治療股骨頭壞死的可能潛在作用機(jī)制。運(yùn)用Cytoscape3.8.2 繪制“中藥-靶點(diǎn)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分析，按照 Degree 值大小篩選排名靠前的活性成分作為核心成分。

6 分子對(duì)接

于PubChem 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載牛膝- 續(xù)斷核心成分的2D 結(jié)構(gòu)，作為 配 體。于PDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載PPI 獲得的核心基因相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，作為受體。在Pymol 軟件對(duì)受體蛋白去水、加電荷、加氫。配體及受體均需在AutoDock1.5.6 更改為pdbqt 格式。運(yùn)用Pymol 獲得對(duì)接盒子xyz 坐標(biāo)軸參數(shù)，輸入Autodock-Vina 開(kāi)始分子對(duì)接，這時(shí)計(jì)算機(jī)CPU 運(yùn)算得出最低結(jié)合能。PyMol 獲得的受體與配體結(jié)合的復(fù)合物，導(dǎo)入PLIP 平臺(tái)進(jìn)行分析，使用PyMol 對(duì)最佳分子對(duì)接模式進(jìn)行可視化。

結(jié)果

1 牛膝-續(xù)斷活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

依照上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，去重后共得出牛膝-續(xù)斷藥對(duì)27 種活性成分及202 個(gè)靶基因，見(jiàn)表1。

2 股骨頭壞死靶點(diǎn)獲取結(jié)果

選取國(guó)際公認(rèn)的GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）中，去重得出股骨頭壞死聯(lián)系密切的已知潛在靶點(diǎn)2302 個(gè)。

3 藥物與疾病的共同靶點(diǎn)獲取

通過(guò)R 語(yǔ)言得到共同靶點(diǎn)125 個(gè)，于Venny2.1在線平臺(tái)繪制韋恩圖。見(jiàn)圖1。

4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

依照上述標(biāo)準(zhǔn)，使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)PPI 分析功能處理共同靶點(diǎn)，刪除1 個(gè)離散節(jié)點(diǎn)，選擇tsv 格式文件下載，并且導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖2。PPI 關(guān)系互作圖包括124 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2484 條邊，利用CytoNCA 插件拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，根據(jù)接近中心性CC、借助度中心性DC、介度中心性BC、局部邊連通性LAC 和網(wǎng)絡(luò)中心性NC、特征向量中心性EC 這6 個(gè)指標(biāo)，以大于中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行3 次計(jì)算分析，過(guò)程見(jiàn)圖3。獲得5 個(gè)核心基因，分別是AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN。見(jiàn)表2。

表2 核心基因

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心基因篩選流程圖

5 GO 靶點(diǎn)通路分析結(jié)果

GO 富集分析表明，牛膝-續(xù)斷治療股骨頭壞死靶點(diǎn)影響了2047 個(gè)生物學(xué)過(guò)程，43 個(gè)細(xì)胞組分，128個(gè)分子功能。BP 主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)、對(duì)異種刺激的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)。對(duì)類(lèi)固醇激素的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、傷口愈合、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)輻射的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)脅迫的反應(yīng)等；CC 主要與膜筏、膜微域、凹陷、水泡腔、質(zhì)膜筏、分泌顆粒管腔、胞質(zhì)小泡腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、富含無(wú)花果-1 的顆粒管腔、細(xì)胞器外膜等相關(guān)；MF 主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合等。選取富集結(jié)果每項(xiàng)顯著性前10 繪制柱狀圖，展示GO 功能與其涉及基因數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)圖4。

圖4 GO 富集分析

6 KEGG 富集分析結(jié)果

共同靶點(diǎn)KEGG 富集分析（P＜0.05）得到通路165 條，富集比較明顯的前20 個(gè)通路包括：脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體AGE-RAGE信號(hào)通路、流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙肝、前列腺癌、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、化學(xué)致癌-受體激活、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、恰加斯病、胰腺癌、麻疹、甲型流感、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒感染、弓形蟲(chóng)病等。見(jiàn)圖5。

圖5 KEGG 富集分析

7 “中藥-靶點(diǎn)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將KEGG 富集分析篩選出的20 條信號(hào)通路，運(yùn)用Cytoscape3.8.2 分析“中藥- 靶點(diǎn)- 疾病- 通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包括286 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1080 條邊，利用CytoNCA 插件拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，Degree 值越大網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)越大。見(jiàn)圖6。并按照 Degree 值大小篩選出排名前5 的活性成分作為牛膝-續(xù)斷的核心成分。見(jiàn)表3。

圖6 “中藥-靶點(diǎn)-疾病-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 Degree 值排名前5 的活性成分

8 分子對(duì)接分析結(jié)果

選擇核心成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素作為小分子配體，選擇核心基因AKT1（PDB 2Z25）、TNF（PDB 2Z25）、IL6（PDB 1ALU）、TP53（PDB 4MZI）、JUN（PDB 1JNM）作為受體，進(jìn)行虛擬分子對(duì)接。研究表明，結(jié)合能為負(fù)數(shù)時(shí)配體與受體不需要外界助力即可結(jié)合，并且結(jié)合能的數(shù)值越低，對(duì)接模式越穩(wěn)定。見(jiàn)表4。結(jié)果可知，槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素與AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN 這5 個(gè)靶點(diǎn)能形成穩(wěn)定氫鍵，且結(jié)合能均為負(fù)數(shù)，表明牛膝-續(xù)斷治療股骨頭壞死效果頗佳。對(duì)結(jié)合能均低于-10kJ/mol 的6 種對(duì)接模式，使用PyMol 軟件進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖7。

圖7 分子對(duì)接模式圖

表4 牛膝-續(xù)斷核心成分與靶點(diǎn)的結(jié)合情況

討論

股骨頭壞死與血液紊亂、代謝和凝血障礙有關(guān)[7]。在中醫(yī)理論中雖無(wú)本病名稱(chēng)，但是發(fā)病癥狀及體征判斷可與中醫(yī)學(xué)中“骨痹”相吻合。因而中醫(yī)理論對(duì)本病的臨床治療指導(dǎo)作用毋庸置疑。王均玉等[8]通過(guò)經(jīng)筋理論對(duì)股骨頭壞死的癥狀進(jìn)行對(duì)癥干預(yù)，以促進(jìn)局部血液循環(huán)實(shí)現(xiàn)良好治療目的。張濤等[9]從血瘀理論出發(fā)，運(yùn)用骨蝕方以及配合蛙泳姿勢(shì)對(duì)股骨頭壞死早期干預(yù)達(dá)到良好效果。這說(shuō)明中醫(yī)學(xué)中“血瘀”理論與本病關(guān)系極其密切。因而探討牛膝-續(xù)斷藥對(duì)對(duì)于活血化瘀方法干預(yù)股骨頭壞死，其理論對(duì)臨床有重要指導(dǎo)價(jià)值。

中藥藥對(duì)“牛膝—續(xù)斷”與股骨頭壞死疾病取共同交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)數(shù)為125 個(gè)，說(shuō)明此藥對(duì)存在股骨頭壞死相關(guān)干預(yù)作用機(jī)制。文獻(xiàn)研究顯示，長(zhǎng)期小劑量應(yīng)用或短期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素均可通過(guò)影響ROS/JNK/c-Jun 通路相關(guān)作用誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死[10]。又PRP-Exos 可通過(guò)介導(dǎo)Akt/Bad/Bcl-2 信號(hào)通路來(lái)抑制糖皮質(zhì)激素相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而誘導(dǎo)股骨頭壞死大鼠的細(xì)胞凋亡[11]。已有研究表明，股骨頭缺血性壞死患者血清和骨組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平高于正常人，提示TNF-α 可能在股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制中起一定作用。其研究數(shù)據(jù)顯示，與健康患者相比，股骨頭缺血性壞死患者骨組織中TNF-α 表達(dá)顯著上調(diào)，并且明顯激活了p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。文獻(xiàn)顯示，雖然有部分p38mapk/NF-κB 通路的抑制顯著減弱了TNF-α誘導(dǎo)的自噬，但增強(qiáng)了TNF-α 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。股骨頭壞死患者體內(nèi)TNF-α 增加，通過(guò)p38-MAPK/NF-κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞自噬和凋亡，進(jìn)而抑制自噬流量阻斷該通路，從而加劇TNF-α 誘導(dǎo)的凋亡[12]。TP53 也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。股骨頭壞死患者骨髓以及成骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致股骨頭頭部出現(xiàn)塌陷，頭部與髖臼連接的圓形表面變平，最終引發(fā)繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎[13]。IL6 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的主要參與者[14]，可參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，造血，急性期反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等相關(guān)生物過(guò)程[15]。而股骨頭壞死最終伴隨骨性關(guān)節(jié)炎[16]，因而與IL6 的參與密不可分。

本次研究顯示，“中藥-靶點(diǎn)-疾病-通路”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中含有最多相關(guān)靶基因的有效成分分別為槲皮 素（Quercetin）、β- 谷 甾 醇（Beta-sitosterol）、山柰酚（Kaempferol）、漢黃芩素（Wogonin）以及黃芩素（Baicalein）。其中，槲皮素（Quercetin）為一種從植物中提取的多酚，其擁有包括抗炎在內(nèi)等多種生物學(xué)作用[17]。山柰酚（Kaempferol）為膳食類(lèi)生物黃酮之一，通過(guò)抑制脂肪形成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，拮抗破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，激活成骨細(xì)胞自噬，從而實(shí)現(xiàn)骨保護(hù)作用[18]，對(duì)股骨頭壞死在內(nèi)的骨性關(guān)節(jié)炎有良好干預(yù)。并且漢黃芩素（Wogonin）和黃芩素（Baicalein）也可抗氧化，抗炎和抗細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血性疾病也有良好干預(yù)作用[19]。

KEGG 分析結(jié)果顯示，脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化，IL-17 信號(hào)通路，腫瘤壞死因子信號(hào)通路，流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化，缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路為主要信號(hào)通路。根據(jù)文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化所相關(guān)的脂質(zhì)代謝異常的危險(xiǎn)因素，包含股骨頭壞死在內(nèi)的多種疾病[20]。這也正如中醫(yī)理論中所言，營(yíng)氣為濡養(yǎng)全身的重要物質(zhì)，是化生血的主要來(lái)源。又因氣為血之帥，而統(tǒng)領(lǐng)血行；而血為氣母，濡養(yǎng)一身之氣，二者相關(guān)密不可分。氣屬無(wú)形而血屬有形，形者為精微物質(zhì)即氣血的最終客觀形體存在，骨為精所化，髓乃精所生，氣血不暢則精無(wú)生而骨乃壞也。內(nèi)皮細(xì)胞將血液流動(dòng)的摩擦力（流體剪切力）轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)，通過(guò)特殊的機(jī)制和途徑調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞行為。這些通路在發(fā)育期間、出生后和成年時(shí)期塑造血管系統(tǒng)，以優(yōu)化流向組織的流動(dòng)。這些途徑也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和血管畸形[21]，導(dǎo)致局部血流變化甚至血流量減少，而股骨頭周?chē)髁考熬植垦鞯臏p少，被認(rèn)為是發(fā)病的重要原因之一[22]。同時(shí)腫瘤壞死因子TNF 在炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和免疫系統(tǒng)刺激等方面也是發(fā)揮著重要的多效性作用[23]。

通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，核心成分槲皮素、β- 谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素與核心蛋白AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN 的結(jié)合能均為負(fù)數(shù)。說(shuō)明核心成分可以自動(dòng)結(jié)合核心蛋白，并且發(fā)揮作用，通過(guò)介導(dǎo)激活或抑制其相關(guān)通路，達(dá)到對(duì)股骨頭壞死的干預(yù)作用。

綜上所述，中藥“牛膝-續(xù)斷”藥對(duì)中包括山奈酚在內(nèi)的多種化學(xué)成分可對(duì)股骨頭壞死發(fā)病進(jìn)行多成分，多靶點(diǎn)，多通路的干預(yù)治療。尤其通過(guò)山奈酚介導(dǎo)其脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化，流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路以達(dá)到恢復(fù)股骨頭周?chē)\(yùn)能力，達(dá)到從瘀來(lái)論治本疾病。本研究對(duì)臨床治療股骨頭壞死的作用機(jī)制具有借鑒意義，同時(shí)也為更臨床應(yīng)用提供了理論支撐。但由于數(shù)據(jù)庫(kù)信息不全面、藥材成分差異等問(wèn)題，結(jié)論仍待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證。