妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平對藏母羊泌乳性能的影響及乳腺轉(zhuǎn)錄組分析

周 力 姜洋洋 李蔣偉 張峰碩 楊葆春 王志有 桂林生 侯生珍

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

轉(zhuǎn)錄組是研究功能基因組的重要手段，不僅包括編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，還包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)以及環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)等非編碼RNA[1]。細(xì)胞或組織的特定表型不僅受蛋白質(zhì)編碼RNA(mRNA)的調(diào)控，還與基因組中非編碼RNA密切相關(guān)。這些RNA轉(zhuǎn)錄物并非單一、獨(dú)立的，而是能夠通過特定的形式調(diào)控彼此功能，這種調(diào)控機(jī)制被稱之為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)機(jī)制[2]。目前在人[3]、奶牛[4]、山羊[5]等上均有乳腺組織轉(zhuǎn)錄組分析的報(bào)道，但關(guān)于綿羊乳腺組織相關(guān)功能的報(bào)道甚少。以小尾寒羊?yàn)檠芯繉ο螅l(fā)現(xiàn)飼糧營養(yǎng)水平能夠?qū)ζ渖臣に睾兔谌樾阅墚a(chǎn)生明顯的影響[6]。當(dāng)飼糧能量水平恒定為12.92 MJ/kg 時(shí)，隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的升高，西農(nóng)薩能羊泌乳量以及乳蛋白量變化雖不明顯，但乳脂率能隨之顯著提高[7]。由此可以看出，飼糧蛋白質(zhì)水平與反芻動物的泌乳性能具有一定的關(guān)系。

藏羊(Tibetan sheep)作為我國特有的綿羊品種資源，其體格粗壯、抗寒、耐粗飼，對青藏高原極端惡劣的自然環(huán)境與氣候條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[7]。乳用性能是評價(jià)乳用綿羊是否優(yōu)質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)志，處于泌乳時(shí)期的母畜不斷從飼糧中攝取營養(yǎng)物質(zhì)來維持生命與生產(chǎn)活動，飼糧營養(yǎng)水平在很大程度上決定了高峰期泌乳量與泌乳持續(xù)力。母羊妊娠期正處于枯草季節(jié)，此時(shí)草場生產(chǎn)力與牧草營養(yǎng)嚴(yán)重不足，這不僅會影響機(jī)體維持自身以及產(chǎn)后泌乳的需要，同時(shí)還會限制后代胎兒的發(fā)育[8]。研究證實(shí)，反芻動物的泌乳量直接決定了多羔的成活率，還可明顯影響羔羊的生長發(fā)育[9]。此外，妊娠期也是母畜乳腺發(fā)育的關(guān)鍵階段，此時(shí)若能了解飼糧蛋白質(zhì)水平對藏母羊泌乳性能的影響，并揭示其調(diào)控乳腺發(fā)育的分子機(jī)理，對于其泌乳性能的遺傳改良具有重要的指導(dǎo)意義。

鑒于此，本研究擬以青海省海東市高原型藏羊?yàn)檠芯繉ο?，通過采集泌乳后期乳腺組織，利用RNA-seq技術(shù)對飼喂高、低蛋白質(zhì)水平飼糧的藏母羊的乳腺組織差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)進(jìn)行篩選，并通過GO功能注釋、KEGG富集分析來挖掘控制藏羊乳腺發(fā)育的相關(guān)候選基因，旨在為解析綿羊泌乳性能的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

動物飼養(yǎng)試驗(yàn)于2018年10月7日至2018年12月10日在青海省海東市樂都金元牧業(yè)有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)羊只為高原型藏羊。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼喂管理

試驗(yàn)選取體重[(45.35±2.43) kg]相近且發(fā)育正常的妊娠后期藏母羊60只(經(jīng)產(chǎn)2胎，單羔)，隨機(jī)分2組，每組30只。LP組飼喂蛋白質(zhì)水平為7.5%的飼糧，HP組飼喂蛋白質(zhì)水平為11.5%的飼糧。試驗(yàn)歷時(shí)65 d(配種后第85～150天)，包括預(yù)試期5 d與正試期60 d?；A(chǔ)飼糧參照我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)并結(jié)合藏羊生長的營養(yǎng)需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，其組成及營養(yǎng)水平見表1。精料補(bǔ)充料每日攝入量0.25 kg，粗飼料由燕麥干草與燕麥青貯以1∶1(按干物質(zhì)計(jì))組成，每日攝入量為3 kg，精料補(bǔ)充料與粗飼料混合攪拌后飼喂。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

試驗(yàn)開始前對整個(gè)圈舍進(jìn)行全面的消毒，按照羊場正規(guī)程序?qū)υ囼?yàn)羊進(jìn)行防疫。采用全舍飼單欄飼養(yǎng)，每天08:00和18:00各飼喂1次，自由采食和飲水。每天清洗料槽與水槽，定期消毒，保持圈舍通風(fēng)、干燥和衛(wèi)生等。母羊泌乳量采用羔羊吃奶前后稱重法測定。于試驗(yàn)第62～64天(配種后第147～149天)，每日哺乳3次(08:00、13:00、18:00)，完成哺乳后對羔羊進(jìn)行體重稱量并與母羊隔離，當(dāng)日泌乳量為3次測定的總和。同時(shí)收集乳汁5 mL，將每只試驗(yàn)羊3 d采集到的乳汁進(jìn)行混勻，用于乳成分分析。配種后第150天，每組各采集3只試驗(yàn)羊右側(cè)乳腺組織放入無RNA酶凍存管，置于液氮中保存待用。

1.3 羔羊體況測定

分別在羔羊初生以及羔羊飼養(yǎng)第30天、第60天(斷奶時(shí))測定其體重，并計(jì)算平均日增重(average daily gain，ADG)，計(jì)算公式如下：

平均日增重(g/d)=1 000×[斷奶體重(kg)-
初生重(kg)]/飼養(yǎng)時(shí)間(d)。

1.4 母羊乳成分分析

乳成分測定：乳蛋白率、乳脂率、乳糖率均用FOSS 120型乳成分分析儀(丹麥)檢測。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序

通過總RNA提取試劑盒對藏羊乳腺組織總RNA進(jìn)行提取。使用超微量核酸蛋白儀檢測提取RNA的濃度與純度，再利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。所有樣品RNA提取并檢測合格后，用干冰保存并送至廣州基迪奧生物科技有限公司，應(yīng)用Illumina NovaSeq 6000高通量測序平臺進(jìn)行RNA-seq測序。

總RNA提取試劑盒、FastKing RT Kit cDNA第1鏈合成試劑盒以及SuperReal PreMix Color(SYBR Green)等試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。

為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，嚴(yán)格按照廣州基迪奧生物科技有限公司的數(shù)據(jù)處理步驟，對下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控與過濾，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。然后使用比對軟件Tophat 2將過濾掉核糖體RNA的reads比對到物種的參考基因組上，獲得藏母羊乳腺樣本特異序列信息。

采用差異表達(dá)倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)以及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)值對不同處理間基因表達(dá)差異的程度進(jìn)行篩選，滿足|log2(FC)|>2且FDR<0.05定義為DEGs。進(jìn)一步結(jié)合GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對篩選出的DEGs進(jìn)行功能注釋、GO分類及KEGG通路分析，以P<0.05作為相關(guān)基因富集到的差異生物學(xué)通路篩選條件。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

為了對轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，從最顯著的前5條通路中挑選出5個(gè)DEGs使用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表2)。通過Fast Quant RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，符合要求的cDNA按照Super ReaPreMix Plus Kit在羅氏Light Cyler 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系為：2×Super Real Color PreMix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，加RNase-free ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 min；變性95 ℃ 10 s；退火/延伸60 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，以胰島素樣生長因子1(IGF1)、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、蛋白絡(luò)氨酸激酶(SRC)和Ⅵ型膠原蛋白A5(COL6A5)為目的基因，相關(guān)引物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，目的基因相對定量的結(jié)果采用2-△△Ct法[10]進(jìn)行計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2019初步整理后，采用t檢驗(yàn)比較分析2組試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，P<0.05作為差異顯著水平，P<0.01作為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 2組羔羊生長性能比較

2組羔羊的體重與平均日增重結(jié)果如表3所示。2組羔羊的初生重、第30天體重以及斷奶體重(第60天體重)均無顯著差異(P>0.05)，但HP組羔羊的平均日增重比LP組提高了16.40%(P<0.05)。

2.2 2組藏母羊泌乳性能比較

藏母羊的日產(chǎn)奶量和乳成分結(jié)果如表4所示。與LP組相比，HP組藏母羊的日產(chǎn)奶量提高了19.58%，同時(shí)乳糖率、乳脂率以及乳蛋白率分別提高了22.07%、24.84%、18.70%，2組間差異均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

2.3 乳腺轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估

本試驗(yàn)利用Illumina NovaSeq 6000高通量測序平臺對LP組與HP組藏羊乳腺組織(每組3個(gè)樣本)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序。如表5所示，所有樣本原始序列(raw reads)數(shù)目均在46 645 540～59 793 388個(gè)范圍內(nèi)，去除接頭和低質(zhì)量的reads，最后過濾后序列(clean reads)數(shù)目均在46 135 380～59 177 836個(gè)范圍內(nèi)，占raw reads的比例為98.91%～99.05%。LP組與HP組Q20和Q30比例均在96%以上，GC含量在48.98%～51.27%，說明測序堿基識別時(shí)出錯(cuò)的概率較低，堿基含量接近。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下，映射到基因組的序列(total mapped reads or fragments)比例≥70%，其中具有多個(gè)定位的測序序列(multiple mapped reads or fragments)占總體的百分比≤10%。本試驗(yàn)通過使用比對軟件Tophat 2將過濾掉核糖體RNA的reads比對到參考基因組上，最后發(fā)現(xiàn)所有樣本比對到參考基因組上的reads占clean reads的比例均高于98%，符合試驗(yàn)要求，滿足后續(xù)生物信息數(shù)據(jù)分析的需要。

表2 RT-qPCR引物信息

表3 羔羊的體重與平均日增重

表4 藏母羊的日產(chǎn)奶量與乳成分

對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖1-A所示，2組的第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)解釋率分別為54.50%、35.80%，2組累計(jì)可達(dá)90.30%，說明2組之間分離趨勢較為明顯，樣本分組合理。此外，在基因豐度為1時(shí)，發(fā)現(xiàn)2組間共有基因數(shù)為8 827個(gè)，其中878個(gè)基因?yàn)長P組特有，120個(gè)基因?yàn)镠P組特有(圖1-B)。

表5 樣本測序數(shù)據(jù)評估

LP：LP組；HP：HP組。下圖同。

2.4 DEGs篩選、功能注釋和富集分析

2.4.1 DEGs篩選

通過DEGs火山圖(圖2)可以非常直觀地篩選出LP組與HP組的DEGs。DEGs火山圖中x軸表示log2(FC)值，y軸表示-lg(FDR)值。結(jié)果顯示，低、高蛋白質(zhì)水平飼糧條件下藏母羊乳腺組織DEGs達(dá)到了40個(gè)，其中上調(diào)基因11個(gè)，下調(diào)基因29個(gè)。

2.4.2 DEGs功能富集分析

為了進(jìn)一步了解藏母羊乳腺組織中DEGs的功能，利用GO數(shù)據(jù)庫對篩選出的DEGs進(jìn)行富集分類，可分為生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)(圖3)。在BP、MF以及CC中，DEGs所富集的GO的條目分別為16、9和4個(gè)。在BP組分中，2組間DEGs在細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、單組織進(jìn)程(single organism process)及代謝進(jìn)程(metabolic process)上富集到的DEGs數(shù)目最多；在MF組分中，DEGs在細(xì)胞組分(cell part)中所占的比例最高，其次為細(xì)胞(cell)和細(xì)胞器(organelle)；在CC組分中，DEGs在結(jié)合(binding)中所占比例最大。

2.5 KEGG通路注釋

通過對乳腺DEGs進(jìn)行KEGG通路分析，共獲得30條差異信號通路，最顯著的前5個(gè)信號通路依次為Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、煙酸和煙酰胺代謝(nicotinate and nicotinamide metabolism)、果糖和甘露糖代謝(fructose and mannose metabolism)、礦物質(zhì)吸收(mineral absorption)、磷脂酰肌醇-3-激酶-絲/蘇氨酸蛋白激酶信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)；此外，還發(fā)現(xiàn)黑素原生成(melanogenesis)、鞘脂類信號通路(sphingolipid signaling pathway)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)以及脂肪細(xì)胞內(nèi)脂解的調(diào)節(jié)(regulation of lipolysis in adipocyte)等與泌乳量及乳品質(zhì)緊密關(guān)聯(lián)的差異信號通路。

2.6 RT- qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq測序結(jié)果的可靠性，從DEGs中選取了IGF1、SRC、CCND1、COL6A5以及STAT3基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，并與其測序結(jié)果進(jìn)行對比。從圖4可知，所選擇的5個(gè)基因在2種方法中表達(dá)趨勢一致，說明本次試驗(yàn)RNA-seq測序結(jié)果較為可靠。

圖2 DEGs火山圖

圖3 DEGs的GO分析

3 討 論

3.1 藏母羊妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平對羔羊生長性能的影響

青藏高原地區(qū)氣候嚴(yán)寒，枯草期長達(dá)7個(gè)月以上，牧草匱乏，營養(yǎng)價(jià)值偏低，粗蛋白質(zhì)含量不足5%，造成羊只的營養(yǎng)需要得不到滿足，生長發(fā)育受阻，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)掉膘，甚至發(fā)生死亡[11]。加上妊娠母羊因供養(yǎng)與帶羔哺乳體能和營養(yǎng)消耗極大，若不能得到及時(shí)補(bǔ)充，羔羊的生長發(fā)育會因母體體況不佳、營養(yǎng)不良等出現(xiàn)流產(chǎn)或死胎現(xiàn)象，不利于實(shí)際生產(chǎn)。此外，初生羔羊由于消化器官尚未發(fā)育完全，若飼糧管理稍有疏忽，不僅會影響今后的發(fā)育潛力，還會增加死亡率，給牧場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在高寒牧區(qū)實(shí)施精粗飼養(yǎng)對于維持妊娠后期藏母羊自身以及子代羔羊發(fā)育至關(guān)重要。Griffiths等[12]認(rèn)為，母羊妊娠期的體況與其胎兒初生重和生長性能直接相關(guān)，在妊娠期體重增加較好的母羊能更好地哺育胎兒，從而促進(jìn)生長發(fā)育。這說明妊娠期母羊的生長發(fā)育與其子代羔羊關(guān)系緊密。以北川白山羊?yàn)檠芯繉ο?，結(jié)果顯示14%蛋白質(zhì)組平均日增重顯著低于16%蛋白質(zhì)組[13]。此外，雷耀庚等[14]指出，飼糧蛋白質(zhì)水平與平均日增重和養(yǎng)分消化率有關(guān)?；谏鲜鋈藛T的研究結(jié)論可以看出，反芻動物的生長發(fā)育受飼糧蛋白質(zhì)水平的影響較大，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。在本試驗(yàn)中，LP組羔羊的平均日增重顯著低于HP組。分析原因可能是11.5%蛋白質(zhì)水平飼糧能夠提供更多易于消化吸收的碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，有助于母羊瘤胃微生物繁殖和促進(jìn)微生物蛋白合成，進(jìn)而影響新生羔羊發(fā)育[15]。

IGF1：胰島素樣生長因子1 insulin-like growth factor 1；CCND1：細(xì)胞周期蛋白1 cyclin D1；STAT3：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 signal transduction and transcriptional activation factor 3；SRC：蛋白絡(luò)氨酸激酶 sarcoma；COL6A5：Ⅵ型膠原蛋白A5 type Ⅳ collagen A5。

3.2 妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平對藏母羊泌乳性能的影響

泌乳性能是衡量奶畜生產(chǎn)性能的主要指標(biāo)，其中產(chǎn)奶量是奶畜產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的重要保障。乳中營養(yǎng)成分可為胎兒提供生長發(fā)育所需的各種營養(yǎng)素，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及礦物質(zhì)等[16]。因此，泌乳期母羊的產(chǎn)奶量和乳成分對羔羊的生長發(fā)育十分重要。泌乳性能主要與飼糧營養(yǎng)水平的調(diào)整有關(guān)，飼糧蛋白質(zhì)水平通過改變反芻動物瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的比例，進(jìn)而影響母畜的泌乳性能與健康狀況。蛋白質(zhì)水平對嶗山奶山羊采食量無顯著影響，但對產(chǎn)奶量、料奶比及乳成分有不同程度的影響[17]。飼糧蛋白質(zhì)水平從16%提高至19%后，能夠顯著提高荷斯坦奶牛的干物質(zhì)攝入量、產(chǎn)奶量以及乳糖含量[18]。研究表明，精粗比為65∶35組關(guān)中奶山羊的產(chǎn)奶量極顯著高于精粗比為35∶65組，同時(shí)乳中乳糖和乳蛋白的比例隨著泌乳時(shí)間的增加而顯著升高[19]。當(dāng)飼糧蛋白質(zhì)水平由16%提高到18%時(shí)，卻對西農(nóng)薩能羊的泌乳性能和乳品質(zhì)無任何影響[20]。在奶山羊上亦證實(shí)不同能量或蛋白質(zhì)水平飼糧對奶山羊乳脂率的影響不顯著[21]。但也有試驗(yàn)所得結(jié)論[22]與上述研究相反。這可能是由于試驗(yàn)動物、飼養(yǎng)管理以及飼糧蛋白質(zhì)水平梯度不同所致。此外，為了進(jìn)一步了解飼糧營養(yǎng)水平與藏羊泌乳性能的關(guān)系，本試驗(yàn)測定了2組藏母羊的產(chǎn)奶量及乳成分，結(jié)果顯示，HP組藏母羊的產(chǎn)奶量、乳糖率、乳脂率以及乳蛋白率均顯著高于LP組。這提示妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平由7.5%提高到11.5%時(shí)，可以顯著提高藏母羊的產(chǎn)奶量，并有效改善乳品質(zhì)。

3.3 妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平對藏母羊乳腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響

乳腺作為哺乳動物特有的器官，其主要功能是泌乳，不僅在繁育后代過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而且對于人類健康具有重要意義[23]。乳腺的發(fā)育主要受到遺傳、環(huán)境以及激素等因素的影響[24-25]，飼糧營養(yǎng)水平對乳腺的發(fā)育也起著關(guān)鍵作用[26]。Gómez-Martínez等[27]給泌乳期奶牛飼喂不同能量水平(分別為凈能需求量的85%、100%及115%)的飼糧，結(jié)果顯示飼糧能量水平可顯著影響乳腺相關(guān)基因的表達(dá)，并且DEGs主要富集于免疫通路上，一定程度上能夠決定乳房炎的發(fā)生。當(dāng)荷斯坦奶牛每天攝入700 g的葵花油(不飽和脂肪酸)，可顯著上調(diào)乳腺與乳蛋白合成緊密相關(guān)基因的表達(dá)，如胰蛋白酶原2(PRSS2)、卵黃狀黃斑病蛋白3(BEST3)等[28]。當(dāng)飼糧中亞麻籽含量達(dá)到20%時(shí)，綿羊乳腺組織中參與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成的基因的表達(dá)顯著受到抑制，導(dǎo)致乳中乳蛋白、乳脂以及乳糖含量下降[29]。本研究對乳腺組織中DEGs進(jìn)行GO分類以及KEGG分析，發(fā)現(xiàn)多條與能量和脂質(zhì)代謝緊密相關(guān)的差異信號通路，如煙酸和煙酰胺代謝、果糖和甘露糖代謝、鞘脂類信號通路、雌激素信號通路以及脂肪細(xì)胞內(nèi)脂解的調(diào)節(jié)。這說明飼糧蛋白質(zhì)水平對動物乳腺的生理和代謝具有一定的影響。另外，本試驗(yàn)挑選出5個(gè)與乳腺組織生長發(fā)育相關(guān)的DEGs進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證，并與其測序結(jié)果一致，這表明RNA-seq測序結(jié)果可靠。在本試驗(yàn)中，與高蛋白質(zhì)水平飼糧相比，低蛋白質(zhì)水平飼糧顯著降低了IGF1和SRC的相對表達(dá)量，并增加了CCND1、COL6A5和STAT3的相對表達(dá)量。

IGF1能夠介導(dǎo)生長激素，從而啟動JAK-STAT信號通路，調(diào)節(jié)泌乳性能。同時(shí)，IGF1可促進(jìn)機(jī)體對葡萄糖的攝取，調(diào)節(jié)糖原異生與糖酵解，促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪合成[30]。其他試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，相較于中蛋白質(zhì)水平飼糧與低蛋白質(zhì)水平飼糧，高蛋白質(zhì)水平飼糧能顯著提高IGF1基因表達(dá)[31]。而本試驗(yàn)得出，LP組藏母羊能夠顯著降低IGF1的相對表達(dá)量。這表明低蛋白質(zhì)水平飼糧導(dǎo)致母羊產(chǎn)奶量下降可能與IGF1表達(dá)下降有關(guān)。低蛋白質(zhì)水平飼糧除了降低母畜的泌乳性能，同時(shí)還會影響細(xì)胞和體液免疫，使母畜容易發(fā)生乳房炎、乳腺癌等疾病。CCND1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，現(xiàn)已被證實(shí)為原癌基因，其過度表達(dá)或錯(cuò)誤調(diào)控均可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[32]。而STAT3主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡，對細(xì)胞的生長發(fā)育起著重要作用[33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LP組母藏羊CCND1和STAT3的相對表達(dá)量顯著升高，這暗示在低蛋白質(zhì)水平飼糧條件下妊娠期藏母羊易發(fā)生疾病，同時(shí)影響機(jī)體健康。SRC是一類由許多細(xì)胞外信號分子激活的非受體蛋白酪氨酸激酶。敲除雌性小鼠中SRC基因能夠?qū)е旅谌槭∫约叭橄俚奶崆巴嘶痆34]。有人指出，SRC基因可能調(diào)節(jié)β-酪蛋白基因的表達(dá)，可能與泌乳性狀直接相關(guān)[35]。本試驗(yàn)中LP組藏母羊的產(chǎn)奶量減少可能也與SRC表達(dá)下降有關(guān)。COL6A5是膠原蛋白家族成員之一，目前關(guān)于COL6A5參與脂代謝的報(bào)道很少。COL6A5表達(dá)抑制可緩解雙氫睪酮引起的脂肪過度積累和細(xì)胞肥大，且對應(yīng)著相應(yīng)的分子活動異常的改善[36]。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，低蛋白質(zhì)水平飼糧顯著提高藏母羊乳腺組織中COL6A5基因的表達(dá)，這提示低蛋白質(zhì)水平飼糧對藏母羊乳腺組織發(fā)育同樣不利。

4 結(jié) 論

① 在本試驗(yàn)條件下，提高藏母羊妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平可增強(qiáng)羔羊的平均日增重與藏母羊的產(chǎn)奶量，并有效促進(jìn)乳中糖、脂肪以及蛋白質(zhì)的合成。

② 通過RNA-seq技術(shù)在藏母羊乳腺組織中鑒定出了40個(gè)DEGs，主要富集于鞘脂類信號通路、雌激素信號通路以及脂肪細(xì)胞內(nèi)脂解調(diào)節(jié)，部分DEGs與能量和糖、脂代謝密切相關(guān)。

③ 綜上可知，適當(dāng)提高藏母羊妊娠后期飼糧蛋白質(zhì)水平，可通過改變?nèi)橄俳M織中的相關(guān)基因表達(dá)，提高藏母羊的泌乳性能及乳品質(zhì)，進(jìn)而提高羔羊的平均日增重。