生物蛋白API對肉兔生長性能和腸道健康的影響

張 莉 湯加勇 賈 剛 田 剛 劉光芒 陳小玲 蔡景義 趙 華

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，成都 611130)

作為節(jié)糧型草食性動物，家兔是我國畜牧業(yè)重要組成部分。家兔腸道健康是制約其生產(chǎn)的重要原因之一，使用抗生素在抑制腸道有害菌生長的同時也抑制有益菌生長，造成腸道微生物菌群失調(diào)，且誘發(fā)更多的耐藥菌，危害生態(tài)環(huán)境。隨著飼料行業(yè)禁抗的推行，尋找代替抗生素提高家兔抗病能力的飼用添加劑是促進(jìn)兔業(yè)持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一?？咕氖且活悘V泛存在于生物體內(nèi)的陽離子兩親性小分子多肽，通常由12～100個氨基酸組成，具有耐熱、耐酸堿、廣譜抗菌和不易產(chǎn)生耐藥性等特點[1]。根據(jù)來源可分為細(xì)菌抗菌肽、植物抗菌肽、昆蟲抗菌肽、水生抗菌肽、動物抗菌肽等；根據(jù)結(jié)構(gòu)特點可分為蛙皮類、防御素類、天蠶類和蜂毒類等。抗菌肽是動物非特異性免疫的重要成分，同時在體液免疫中也起著重要作用，且不同抗菌肽其抗菌范圍不同。鯰魚抗菌肽parasin Ⅰ是從受傷鯰魚上皮黏膜中分離得到，由19個氨基酸組成[2]，具有高效殺菌效果且無溶血性，其抗菌效果是蛙皮素maganin 2的12～100倍，是蟾蜍胃抗菌肽buforin Ⅰ的8倍[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鯰魚抗菌肽parasin Ⅰ可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等有害菌的生長[4]?？咕闹饕饔糜诩?xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的分子效應(yīng)器，其在進(jìn)入動物腸道后可有效抑制有害菌的生長并促進(jìn)有益菌的生長，促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而改善動物生長性能和腸道健康[5]。

目前，在豬、禽和反芻動物上的研究均表明抗菌肽可提高牲畜生長性能，改善腸道微生物組成，促進(jìn)腸道健康[6-7]，而在家兔上的研究相對較少。生物蛋白API為本課題組成功設(shè)計表達(dá)的包含鯰魚抗菌肽parasin Ⅰ功能片段的基因工程蛋白，其對家兔的生長性能及腸道健康等是否有效還有待進(jìn)一步研究。因此，本試驗旨在研究飼糧中添加不同水平API在對肉兔生長性能、空腸消化酶活性、盲腸發(fā)酵產(chǎn)物及微生物組成以及空腸緊密連接蛋白和免疫細(xì)胞因子相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響，為其在家兔飼糧中的應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

API為本實驗已構(gòu)建的畢赤酵母陽性菌株表達(dá)的上清液，伊拉商品肉兔購自雅安市天全縣華聯(lián)兔業(yè)農(nóng)民專業(yè)合作社。

1.2 試驗設(shè)計

選取30日齡健康且體重[(644.93±31.92) g]相近的斷奶伊拉商品肉兔144只，根據(jù)平均體重隨機分為4組，每組18個重復(fù)，每個重復(fù)2只兔。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.1、0.5和1.0 mg/kg API。試驗期8周?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1994)營養(yǎng)需要進(jìn)行配制，飼糧類型為4.0 mm顆粒料?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content磷酸氫鈣 CaHPO41.00氯化鈉 NaCl0.30預(yù)混料 Premix1)0.50合計 Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)10.34粗蛋白質(zhì) CP16.01粗脂肪 EE4.25淀粉 Starch16.29粗纖維 CF15.27中性洗滌纖維 NDF33.49酸性洗滌纖維 ADF18.75酸性洗滌木質(zhì)素 ADL4.26鈣 Ca0.92總磷 TP0.54有效磷 AP0.41賴氨酸 Lys0.82蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.52蘇氨酸 Thr0.62

1.3 飼養(yǎng)管理

肉兔飼養(yǎng)試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地進(jìn)行。試驗前清洗兔舍和用具并用甲醛進(jìn)行熏蒸消毒。肉兔飼養(yǎng)于3層金屬籠中，兔舍溫度控制在15～22 ℃，相對濕度66%～78%，自然采光并保證適宜通風(fēng)，每天飼喂5次(07:30、10:00、13:00、15:00、18:30)，自由飲水。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能與健康狀況

試驗期間，以重復(fù)為單位，記錄各組肉兔每周的給料量、廢料量和余料量；分別于第1天、第28天和第56天對肉兔空腹稱重。計算各組肉兔平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。每日觀察并記錄肉兔腹瀉和死亡情況，計算肉兔腹瀉率、死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)[8]。

1.4.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，按平均體重選取24只健康肉兔(每組6只)，屠宰后立即取出盲腸，用pH計(PHSJ-3D)測定盲腸食糜pH，取前、中、后3處測定后計算平均值。同時快速分離腸段，取空腸黏膜、盲腸食糜于凍存管中，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 空腸消化酶活性測定

空腸黏膜的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 盲腸發(fā)酵產(chǎn)物及微生物組成測定

盲腸食糜中的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量用CP-3800型氣相色譜儀測定，氨態(tài)氮(NH3-N)含量用比色法測定[9]。盲腸食糜微生物總DNA采用糞樣DNA提取試劑盒(No.D4015-01，Omega)提取，用SYBRTMGreen染色法(No.RR820A，TaKaRa，10 μL體系)對總菌和大腸桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測，用TaqMan法對乳酸桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測。

1.4.5 空腸緊密連接蛋白和免疫相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量測定

采用RNAiso Plus(No.9109，TaKaRa)提取空腸黏膜總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(No.RR047A，TaKaRa)把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；用SYBR?Primix Ex TaqTMⅡ (No.RR820A，TaKaRa，10 μL體系)對緊密連接蛋白[封閉蛋白-1(Claudin-1)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖小帶蛋白-2(ZO-2)]和免疫相關(guān)基因[(白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]進(jìn)行實時熒光定量(QuantStudio 6，ABI)PCR，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，結(jié)果采用2-△△Ct法計算分析。定量引物序列用Primer Express 3.0設(shè)計，并送至上海生工生物公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行初步整理，對發(fā)病率、死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)進(jìn)行計算，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對其他指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 API對肉兔生長性能和健康狀況的影響

由表2可知，飼糧中添加API對肉兔末重、ADFI、ADG和F/G無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，飼糧中添加API可降低肉兔腹瀉率，0.1 mg/kg API組腹瀉率降低了39.99%，0.5和1.0 mg/kg API組腹瀉率均降低了30.02%；飼糧中添加1.0 mg/kg API可降低肉兔死亡率和健康風(fēng)險指數(shù)，分別降低了37.49%和33.34%。

表2 API對肉兔生長性能和健康情況的影響

2.2 API對肉兔盲腸發(fā)酵產(chǎn)物和微生物組成的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加0.1 mg/kg API可顯著提高盲腸丙酸比例(P<0.05)；飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg API對盲腸丙酸比例無顯著影響(P>0.05)，但在數(shù)值上有所降低。飼糧中添加API對盲腸pH、NH3-N含量、總揮發(fā)性脂肪酸含量、乙酸比例和丁酸比例無顯著影響(P>0.05)；但飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg API組盲腸NH3-N含量在數(shù)值上均低于對照組，且盲腸NH3-N含量隨飼糧中API添加水平增加而降低。與對照組相比，飼糧中添加API可降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，其中1.0 mg/kg API組盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加API對盲腸總菌和乳酸桿菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。

表3 API對肉兔盲腸發(fā)酵產(chǎn)物和微生物組成的影響

2.3 API對肉兔空腸緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

由圖1可知，與對照組相比，飼糧中添加API可提高空腸Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量，且空腸Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量隨飼糧中API添加水平增加而升高，其中1.0 mg/kg API組顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加API對空腸ZO-1和ZO-2的mRNA相對表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

2.4 API對肉兔空腸免疫相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

由圖2可知，與對照組相比，飼糧中添加API可提高空腸IL-2的mRNA相對表達(dá)量，其中0.5和1.0 mg/kg API組顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加API對空腸IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

2.5 API對肉兔空腸消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加1.0 mg/kg API可顯著提高空腸淀粉酶活性(P<0.05)；飼糧中添加0.1、0.5和1.0 mg/kg API均可顯著提高空腸脂肪酶和胰蛋白酶活性(P<0.05)，其中空腸脂肪酶活性分別提高了97.81%、49.07%、45.59%，空腸胰蛋白酶活性分別提高了41.16%、57.26%、55.50%。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

圖2 API對肉兔空腸免疫相關(guān)基因

3 討 論

動物生產(chǎn)中大量使用抗生素降低動物自身免疫力并干擾腸道菌群穩(wěn)態(tài)，抗生素殘留導(dǎo)致有害菌耐藥性提高。因此，在飼料禁抗后，研發(fā)無毒副作用的飼用抗生素替代物是畜牧業(yè)當(dāng)前重要的任務(wù)之一。有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適量抗菌肽具有促進(jìn)動物生長和改善健康的作用。其中，抗菌肽plectasin可促進(jìn)肉雞生長性能[10]，抗菌肽PBD-ml和LUC-n可提高山羊飼料利用率，改善生長性能[6]。也有研究表明抗菌肽對正常生理狀態(tài)下仔豬的生長性能無顯著影響[11]，但能顯著提高大腸桿菌攻毒條件下斷奶仔豬的ADG[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加API對肉兔生長性能無顯著影響，有不同程度降低腹瀉率的作用，當(dāng)添加高水平(1.0 mg/kg)API時，其健康風(fēng)險指數(shù)最低。這表明API對肉兔的健康狀況有一定的改善作用，本結(jié)果與復(fù)合抗菌肽CAP提高仔豬抗病能力和降低腹瀉率結(jié)果[13]相類似。

表4 API對肉兔空腸消化酶活性的影響

肉兔腹瀉主要原因是腸道菌群紊亂，其中盲腸中大腸桿菌是引起腹瀉的主要細(xì)菌之一。抗菌肽MccJ 25可減少肉雞腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量[14]；也有研究表明抗菌肽可抑制有害菌的生長，但對有益菌的生長無顯著影響[15]。本研究中，隨著飼糧中API添加水平的增加，肉兔盲腸大腸桿菌的數(shù)量逐漸降低，表明API能很好地抑制大腸桿菌的生長。同時，盲腸微生物生長繁殖與NH3-N和VFA密切相關(guān)。因為NH3-N是盲腸內(nèi)微生物生長的氮源，其含量降低有利于抑制有害菌的繁殖[16]；VFA(包含乙酸、丙酸和丁酸)是微生物分解碳水化合物的產(chǎn)物，能反映微生物發(fā)酵能力且具有抗炎抗菌的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg API降低了盲腸NH3-N含量，飼糧中添加0.1 mg/kg API提高了盲腸丙酸比例，這預(yù)示著API有提高肉兔盲腸微生物發(fā)酵能力的作用。以上結(jié)果表明，飼糧中添加中、高水平(0.5和1.0 mg/kg)API在一定程度上可降低盲腸NH3-N含量，降低微生物生長的氮源，從而抑制大腸桿菌生長，改善盲腸的微生物菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低肉兔的腹瀉率和死亡率。

腸上皮機械屏障是防止有毒物質(zhì)入侵機體的屏障之一，腸上皮細(xì)胞旁間隙由連接復(fù)合體封閉，其最重要的組成結(jié)構(gòu)是緊密連接蛋白，如Claudin-1、ZO-1和ZO-2。Claudin-1與腸上皮離子轉(zhuǎn)運通道的形成相關(guān)，對維持腸上皮細(xì)胞屏障的完整性及其功能至關(guān)重要[18]。ZO-1是緊密連接蛋白的骨架蛋白，常作為評價腸道屏障功能和通透性的指標(biāo)[19]。緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量的減少可導(dǎo)致膜通透性增加，從而破壞腸道屏障功能。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加API可上調(diào)肉兔空腸Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量，且一定程度地上調(diào)ZO-1、ZO-2的mRNA相對表達(dá)量，與前人的研究結(jié)果[20]一致。這表明API的攝入在一定程度上可降低空腸上皮通透性，改善其機械屏障功能，改善腸道健康，從而上調(diào)了緊密連接蛋白的表達(dá)。

抗菌肽在腸道中除增強機械屏障作用外，還有增強腸道黏膜免疫屏障的作用[21]。腸道不僅是機體的消化器官，也是機體重要的免疫器官。IL-2可增強T細(xì)胞的殺傷活性，對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)至關(guān)重要；IL-6具有促進(jìn)體液免疫的作用[22]。在魚類上的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽hepcidin對斑馬魚肝臟、脾臟、腎臟的IL-2表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用[23]?？咕膕ublancin可提高小鼠脾臟IL-2的表達(dá)[22]。本研究中，飼糧中添加不同水平API均可上調(diào)肉兔空腸IL-2和IL-6的mRNA相對表達(dá)量，且顯著上調(diào)IL-2的mRNA相對表達(dá)量，這表明API的攝入可通過抑制腸道有害菌的生長來增強腸道的免疫屏障功能，改善腸道健康，從而上調(diào)了免疫因子的表達(dá)。

淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶是小腸中主要的消化酶，其活性的高低可反映動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力。腸道消化酶活性和腸道屏障完整性、腸道微生物平衡之間密切相關(guān)。本試驗中，飼糧中添加不同水平API可不同程度地提高肉兔空腸淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性，這與抗菌肽surfactin提高羅非魚腸道消化酶活性研究結(jié)果[24]一致。這表明API的攝入在一定程度上改善了腸道健康，從而提高了腸道的消化酶活性。在本研究中，API的攝入可通過抑制腸道有害菌的生長來增強腸道的機械屏障和免疫屏障功能，從而改善腸道健康，提高腸道消化酶活性，促進(jìn)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

4 結(jié) 論

飼糧中添加API雖然對肉兔生長性能無顯著影響，但可抑制盲腸大腸桿菌生長，改善盲腸微生物平衡；飼糧中API添加水平在1.0 mg/kg時，肉兔的健康風(fēng)險指數(shù)最低，空腸Claudin-1、IL-2的mRNA相對表達(dá)量最高，空腸淀粉酶和胰蛋白酶活性也相對較高。因此，在本試驗條件下，飼糧中API添加水平為1.0 mg/kg時對肉兔的腸道健康改善效果最佳。