大豆異黃酮的代謝及其對動物腸道保護(hù)機(jī)制的研究進(jìn)展

趙慧穎 余詩強(qiáng) 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

大豆異黃酮(soybean isoflavone,SIF)是存在于大豆、紅三葉草等豆科植物中的次級代謝產(chǎn)物，在自然界以游離型苷元和結(jié)合型糖苷2種形式存在[1]。SIF具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和類雌激素樣作用[2-4]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥開發(fā)、食品保健和飼料研發(fā)等諸多領(lǐng)域[5-6]。相關(guān)報(bào)道表明，飼糧中添加SIF可提高動物的免疫能力和生長性能，并可調(diào)節(jié)激素分泌和改善腸道健康[7-8]。隨著人們對SIF生理功能研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)SIF組分能與腸道微生物相互作用生成高生物利用度和高生物活性的新型微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，進(jìn)而充分發(fā)揮SIF的生物活性[9]，但是其在動物體內(nèi)的代謝規(guī)律和對腸道的保護(hù)機(jī)制還鮮有報(bào)道。因此，本文就SIF在動物體內(nèi)的代謝過程及其對腸道的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為SIF的深入研究與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 SIF的理化性質(zhì)及提取工藝

SIF母核為3-苯基苯并二氫吡喃(C15H10O2)[10]，其結(jié)構(gòu)通式如圖1所示，是豆科植物生長過程中產(chǎn)生的一種非甾族雜環(huán)多酚類化合物[11]。SIF主要在植物種子的子葉和胚軸中富集，其中子葉中的含量可占總異黃酮含量的80%～90%[2]，其成分主要分為大豆苷類(daidzin groups)、染料木苷類(genistin groups)、黃豆黃素苷類(glycitin groups)，以游離糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、葡萄糖苷型和丙二?；咸烟擒招?種不同形式存在[12]。SIF糖苷在弱堿性和高溫條件下可水解為乙酰基葡萄糖苷、β-葡萄糖苷，在高溫低pH的條件下還可以進(jìn)一步水解為SIF苷元，由于SIF苷元具有多酚羥基結(jié)構(gòu)，故其還可發(fā)揮還原作用[13-14]。

圖1 大豆異黃酮結(jié)構(gòu)通式

目前SIF的提取方法主要有浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓提取法、超臨界CO2提取法和加熱回流法等[16-21]。各提取方法具體優(yōu)缺點(diǎn)的比較見表1。

2 SIF在動物腸道的吸收和體內(nèi)的代謝

SIF的代謝分為Ⅰ期代謝和Ⅱ期代謝2個階段，SIF在進(jìn)入腸道時須被分解成相應(yīng)的異黃酮苷元才能被吸收發(fā)揮功能，其分解為苷元后進(jìn)入腸道細(xì)胞，部分苷元在酶的作用下轉(zhuǎn)化成葡萄糖醛酸化和磺化衍生物進(jìn)入肝臟，代謝后轉(zhuǎn)入膽汁，隨腸肝循環(huán)再次進(jìn)入腸道[25-27]。在腸道中，異黃酮苷元一部分被腸道上皮吸收，另一部分由芽孢菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬等細(xì)菌分解代謝為雌馬酚等活性物質(zhì)供機(jī)體吸收利用[28]。

表1 大豆異黃酮提取方法比較

2.1 SIF的吸收與代謝

SIF的代謝主要在十二指腸和空腸[29-31]。SIF中的結(jié)合型糖苷被腸腔中的β-葡萄糖苷酶水解為脂溶性苷元和水溶性苷元(染料木素、大豆苷元和黃豆黃素等苷元)，其脂溶性苷元通過被動運(yùn)輸被小腸直接吸收，水溶性苷元則經(jīng)小腸鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸?shù)叫∧c細(xì)胞(運(yùn)輸順序?yàn)槿玖夏舅?大豆苷元>黃豆黃素)。小腸細(xì)胞中有乳糖酶根皮苷水解酶(LPH)及葡萄糖腦苷酶，這些酶通過將異黃酮苷元的7-羥基部分進(jìn)行葡萄糖醛酸化將其代謝為β-D-葡萄糖醛酸和磺酸酯，后擴(kuò)散進(jìn)入血液[32-33]。除了在腸道細(xì)胞中代謝外，十二指腸中的腸球菌、乳酸菌、擬桿菌及彼得桿菌等還可分泌β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酸酶將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸后再擴(kuò)散進(jìn)入血液，代謝產(chǎn)物隨血液進(jìn)入肝臟，肝臟攝取血液中SIF的代謝物如β-甘脲類染料木素、黃豆黃素苷元和大豆苷元再進(jìn)行代謝，此過程為Ⅰ期代謝；隨后，代謝產(chǎn)物被排泄到膽汁中，隨膽汁再次進(jìn)入腸道進(jìn)行二次水解，通過腸肝循環(huán)再次進(jìn)入十二指腸[34-36]?；氐绞改c的SIF代謝物則會進(jìn)入結(jié)腸在腸桿菌、梭狀芽孢桿菌和類桿菌分泌的β-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)和硫轉(zhuǎn)移酶(SULT)的作用下生成雌馬酚、二氫大豆苷元、鄰去甲基安哥拉紫檀素等物質(zhì)，這些產(chǎn)物最終被腸道吸收發(fā)揮其生物功能，部分產(chǎn)物還會被細(xì)菌直接吸收利用，此過程為Ⅱ期代謝[32-34]。簡單來說，SIF首次進(jìn)入腸道再進(jìn)入肝臟進(jìn)行的代謝為Ⅰ期代謝，離開肝臟再次進(jìn)入腸道后進(jìn)行的代謝為Ⅱ期代謝。此外，小腸對大豆苷元和染料木素的7-葡萄糖苷水解速度比肝臟快[37]，其經(jīng)UGT和SULT的硫酸化及葡萄糖醛酸化生成硫酸鹽和葡萄糖醛酸結(jié)合物，經(jīng)體循環(huán)運(yùn)輸?shù)饺淼慕M織進(jìn)行利用，未被利用的物質(zhì)經(jīng)過腎臟排出或通過腸肝循環(huán)進(jìn)入腸道重新代謝或排出[38-40]。其代謝過程如圖2所示。

圖2 大豆異黃酮的Ⅰ期與Ⅱ期代謝

2.2 SIF主要活性成分的代謝方式與產(chǎn)物

SIF的成分多達(dá)12種，但其中主要發(fā)揮作用的只有染料木素和大豆苷元，在食用SIF的動物體內(nèi)能夠被檢測到的主要是染料木素和大豆苷元以及它們的代謝產(chǎn)物，而主要成分之一的黃豆黃素由于功能較弱，對其代謝的研究也不夠清晰[43]。

2.2.1 染料木素

染料木素在Ⅰ期代謝中先被腸道微生物轉(zhuǎn)化為二氫染料木素，二氫染料木素裂解C環(huán)形成6′-羥基-O-去甲基安哥拉紫檀素，之后被進(jìn)一步降解為代謝終產(chǎn)物4-乙基苯酚[44]。部分未完全降解的染料木素被腸道吸收進(jìn)入血液，在血液中生成葡萄糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物后，隨血液進(jìn)入肝臟被代謝為6種羥基化染料木素代謝物，經(jīng)膽汁排泄，通過腸肝循環(huán)進(jìn)入腸道進(jìn)行Ⅱ期代謝[45-47]。血液中的染料木素代謝物到達(dá)心血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)時會被吸收，通過UGT、SULT和鄰苯二酚甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的作用，使其發(fā)生葡萄糖醛酸化、硫酸化和甲氧基化，在COMT的作用下染料木素的芳香羥基化產(chǎn)物中的鄰苯二酚部分生成去甲氧基化硫酸鹽以及甲氧基化葡萄糖醛酸衍生物，進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化等功能，并最終以葡萄糖醛酸和硫酸化合物的形式通過尿液和膽汁被排出體外[46]。

2.2.2 大豆苷元

大豆苷元在腸道中被微生物分解為二氫大豆苷元后最終轉(zhuǎn)化為氧去甲基安哥拉紫檀素(O-DMA)和雌馬酚[48]。大豆苷元Ⅰ期代謝后產(chǎn)生的二氫大豆苷元在大鼠腸壁細(xì)胞內(nèi)的UGT和SULT的作用下，使葡萄糖醛酸與第7位的氧原子偶聯(lián)，生成大豆苷元-7-O-β-D-葡糖苷酸；硫酸鹽與第4′位的氧原子偶聯(lián)，得到大豆苷元-4′-O-硫酸鹽，大豆苷元主要以葡萄糖醛酸和硫酸鹽的形式存在于血液中并隨血液到達(dá)各個器官[49]。O-DMA和雌馬酚主要在結(jié)腸中生成和吸收[50]，梭狀芽孢桿菌和分枝真桿菌可將大豆苷元代謝為O-DMA，雙歧桿菌菌株可將大豆苷元代謝為雌馬酚[51]。在肝臟中，部分大豆苷元被代謝為葡萄糖醛酸和硫酸鹽代謝物排泄入膽汁參與腸肝循環(huán)，進(jìn)入腸道進(jìn)行Ⅱ期代謝；同時，部分大豆苷元會被代謝為6,7,4′-三羥基異黃酮、7,3′,4′-三羥基異黃酮和6,7,3′,4′-四羥基異黃酮后直接進(jìn)入血液后經(jīng)尿液排出[52]。在整個代謝過程中，大豆苷元主要以葡萄糖醛酸和硫酸鹽代謝物的形式經(jīng)尿液排泄，未被代謝的大豆苷元主要經(jīng)糞便排出。大豆苷元的主要代謝過程如圖3所示。

圖3 大豆苷元在體內(nèi)的代謝過程

3 SIF代謝與腸道微生物的交互作用

3.1 腸道微生物對SIF的代謝

SIF主要以游離型和結(jié)合型2種形式存在，游離型主要包括染料木素、大豆苷元、黃豆黃素3種，結(jié)合型則是在游離型的基礎(chǔ)上，以β-糖苷鍵分別與葡萄糖、乙?；咸烟?、丙二?；咸烟窍噙B而成，結(jié)合型糖苷需由腸道微生物作用生成游離型糖苷進(jìn)行代謝[53]。腸道微生物通過還原、甲基化或去甲基化、羥基化或二羥基化和C環(huán)斷裂等反應(yīng)對SIF進(jìn)行代謝[54]，其在不同細(xì)菌的作用下產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物。目前，已分離出一些可以將SIF完全分解的腸道細(xì)菌，其分類見表2。

動物腸道微生物群在不同個體和種屬之間差異顯著，這些細(xì)菌可分為乳酸菌類、斜門厭氧菌類、需氧菌類3類[34,62]。目前已經(jīng)分離鑒定出部分將SIF轉(zhuǎn)化為雌馬酚的細(xì)菌，并揭示了它們的代謝機(jī)制，其中乳酸菌20-92是一種可以將大豆苷元徹底分解的腸道細(xì)菌，其通過分泌NADP(H)依賴性大豆苷元還原酶(L-DZNR)將大豆苷元還原為二氫大豆苷元，這種酶以輔酶NADH為電子供體，通過4Fe-4S簇電子傳遞鏈傳遞電子發(fā)揮還原作用[57]。同時，乳酸菌20-92還可以分泌二氫大豆苷元還原酶(L-DHDR)和四氫大豆苷元還原酶(L-THDR)，這2種酶分別由orf-US2和orf-US3基因編碼，L-DHDR需要在NADPH存在的條件下將二氫大豆苷元還原為四氫大豆苷元，L-THDR將四氫大豆苷元還原為雌馬酚時則不需要NADPH存在[56]。

3.2 SIF對腸道微生物的影響

腸道微生物對SIF的分解可以使SIF更好的發(fā)揮作用，同時SIF也可以通過刺激或改善腸道微生物的結(jié)構(gòu)來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，SIF可直接或間接改變?nèi)四c道關(guān)鍵細(xì)菌群落的數(shù)量或相對比例來維持腸道內(nèi)的微生物平衡[63]。研究表明，雌馬酚可抑制普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp. lactis)和脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)等腸道細(xì)菌，并且染料木素對它們的作用更加強(qiáng)烈，同時黏質(zhì)鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和黏質(zhì)乳桿菌在異黃酮的存在下繁殖速度加快，主要原因是細(xì)菌可將SIF代謝產(chǎn)生的葡萄糖作為自身生長所需的能量來源[63]。SIF的所有成分中染料木素的抗菌活性是最強(qiáng)的，可以通過抑制細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來抑制細(xì)菌DNA復(fù)制，從而起到殺滅有害細(xì)菌的作用[64]。同時，SIF對腸道微生物的作用還可增加雌馬酚的產(chǎn)量以及預(yù)防骨質(zhì)疏松，將SIF和抗性淀粉(RS)飼喂給去卵巢的小鼠，發(fā)現(xiàn)SIF使雙歧桿菌的數(shù)量增加，雙歧桿菌為雌馬酚生成菌，這促進(jìn)了雌馬酚的合成，雌馬酚通過降低骨髓中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)抑制卵巢切除誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)流失，說明SIF和抗性淀粉可調(diào)節(jié)腸道微生物群，通過免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨骼健康[65]。SIF不僅對腸道微生物具有一定的調(diào)節(jié)作用，其對牛瘤胃微生物也具有調(diào)節(jié)作用，在奶?；A(chǔ)飼糧中添加12.5 g的40%的SIF，每天飼喂2次，奶牛瘤胃中的擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和扁平菌門等細(xì)菌的數(shù)量均發(fā)生變化，并使雌馬酚生成菌的數(shù)量增多，進(jìn)而使奶牛乳汁中含有更多的雌馬酚[66]?？傊?，SIF對腸道微生物的調(diào)節(jié)主要通過促進(jìn)或抑制某些腸道微生物的生長，一些腸道微生物(如乳酸桿菌、雙歧桿菌)可以對SIF進(jìn)行初步分解，同時也可將代謝產(chǎn)生的苷元用于自身生長使菌群數(shù)量增加，實(shí)現(xiàn)SIF與腸道微生物之間的相互促進(jìn)[67]。SIF中主要是染料木素發(fā)揮了抑菌作用，對于腸道中的一些機(jī)會致病菌，染料木素可以通過抑制細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ使細(xì)菌的DNA復(fù)制受到抑制，起到抑制有害菌生長的作用，發(fā)揮對腸道微生物的調(diào)節(jié)作用[68]。

表2 腸道微生物對大豆異黃酮的代謝

4 SIF調(diào)控腸道功能

4.1 SIF對腸道運(yùn)動的影響

腸道運(yùn)動依賴于平滑肌細(xì)胞、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)和腸神經(jīng)元間的協(xié)同作用，三者形成的網(wǎng)絡(luò)對調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動起到重要作用[69]。ICC是腸道肌肉內(nèi)的漫波活動和收縮的關(guān)鍵細(xì)胞，存在于小腸起搏區(qū)，通常與靜脈曲張的神經(jīng)末梢緊密相連產(chǎn)生漫波電位，通過縫隙連接將漫波電位傳遞給平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生興奮-收縮耦聯(lián)來發(fā)揮作用[70]。早期研究發(fā)現(xiàn)，染料木素可干擾平滑肌的膽堿能激活，芹菜素和染料木素干擾肌肉興奮或興奮-收縮耦聯(lián)來發(fā)揮抑制作用[71]，但其具體機(jī)制尚未見報(bào)道。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白(MAP)和酪氨酸激酶可參與結(jié)腸ICC起搏電位的產(chǎn)生，通過通道蛋白的直接磷酸化、細(xì)胞內(nèi)第二信使的間接改變或其他蛋白激酶的反式激活來調(diào)節(jié)HCN通道(一種非選擇性陽離子通道，維持或決定自律細(xì)胞的細(xì)胞興奮性)，染料木素則通過抑制HCN通道發(fā)揮其抑制功能[72]。此外，染料木素使胃舒張的作用在很大程度上受分子結(jié)構(gòu)的影響，其基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)為苯并-γ-吡喃酮，具有松弛劑的功能，如果苯并-γ-吡喃酮的C-3上存在羥基，C-2、C-3之間的雙鍵的飽和度降低或C-4羰基缺乏發(fā)生糖基化，胃的舒張功能則會逐漸減弱[73]。Lord等[74]發(fā)現(xiàn)，染料木素通過抑制鈣離子的吸收降低結(jié)腸起搏器活性，同時染料木素還具有潤腸通便的作用，其對雌性小鼠的作用顯著，可增加囊性纖維病雌性小鼠的存活率?？傊琒IF中主要是染料木素發(fā)揮對腸道運(yùn)動的抑制作用，染料木素可通過增加細(xì)胞膜上的K+通道的通透性加速K+的外流，同時阻止Ca2+內(nèi)流，使腸道平滑肌收縮受到抑制[75]。染料木素還可以抑制HCN通道來抑制結(jié)腸ICC起搏電位的產(chǎn)生，并且其本身的結(jié)構(gòu)就具有松弛劑的功能，促使其更好地發(fā)揮對腸道運(yùn)動的抑制作用。

4.2 SIF對腸道屏障的影響

腸道屏障指的是相鄰的腸上皮細(xì)胞形成緊密連接調(diào)節(jié)細(xì)胞旁交通，又通過跨膜蛋白的細(xì)胞外延伸部分相互連接，使緊密連接與相鄰腸細(xì)胞的細(xì)胞骨架完全整合形成腸道屏障[76]。腸道屏障功能受損與某些病理學(xué)和衰老有關(guān)，可能是細(xì)菌感染、肝臟炎癥、食物中毒和自動免疫失調(diào)等原因造成的[77]。一些細(xì)菌侵入動物機(jī)體后分泌脂多糖(LPS)與Toll樣受體4(TLR4)，兩者結(jié)合上調(diào)TLR4-髓樣分化因子88(MyD88)-白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK)信號通路的表達(dá)，通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6激活核因子-κB(NF-κB)信號通路，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)等炎性因子分泌，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而破壞緊密連接使腸道屏障受損[78]。研究表明，染料木素對TLR4具有拮抗作用，可抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4和MyD88的表達(dá)，通過抑制NF-κB的激活來發(fā)揮其抗炎作用，從而保護(hù)腸道屏障[79]。SIF也可通過抑制p38 MAP激酶(p38)的磷酸化及TLR4與LPS的結(jié)合，削弱LPS誘導(dǎo)的炎癥的發(fā)生，增強(qiáng)斷奶仔豬的生長性能和腸道屏障功能[80]。此外，染料木素具有較強(qiáng)的殺菌作用，可阻止細(xì)菌對腸道屏障進(jìn)行破壞，其可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17)減輕炎癥反應(yīng)，抑制腸緊密連接蛋白的酪氨酸磷酸化，緩解氧化應(yīng)激和炎癥因子誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙[81]。程東靜[82]研究表明，SIF可通過增加高脂肥胖大鼠結(jié)腸中杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量來增強(qiáng)腸道的免疫功能，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等促炎因子的表達(dá)及NF-κB的激活，促進(jìn)抗炎因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)的表達(dá)，增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的活性提升抗氧化能力，改善腸道菌群，從而使肥胖大鼠體重減輕，腸道屏障功能得到改善。磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路、5-AMP活化蛋白激酶(AMPK)和雌激素受體β(ERβ)可促進(jìn)腸道緊密連接的形成，而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun N末端激酶(JNK)、p38的炎癥環(huán)境往往會促進(jìn)腸道緊密連接的分解[77]。而SIF可抑制MAPK和p38的產(chǎn)生來保護(hù)腸道緊密連接，SIF還可通過降低TNF-α激發(fā)的小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-6及其他促炎因子基因的表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障功能[83]。

5 小結(jié)與展望

隨著黃酮類活性物質(zhì)對動物代謝調(diào)控和改善腸道健康作用的逐步確認(rèn)，SIF及其代謝物在動物健康調(diào)控方面發(fā)揮的積極作用受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，腸道微生物對SIF進(jìn)行復(fù)雜代謝轉(zhuǎn)化過程時的作用條件、轉(zhuǎn)化時的代謝通路以及具體代謝作用機(jī)理等雖然已有報(bào)道，但其研究尚淺。因此，闡明SIF在動物體內(nèi)的代謝規(guī)律，明確SIF在腸道微生物作用下的代謝通路，解決SIF與腸道微生物的協(xié)同、拮抗關(guān)系，尋找調(diào)控作用中的關(guān)鍵因子將有利于推動動物健康養(yǎng)殖的核心發(fā)展理念，促進(jìn)SIF在畜牧業(yè)中的開發(fā)與應(yīng)用。