朗德鵝TLR4基因的生物信息學(xué)分析

王權(quán)锜，張會新，程 敏，劉玉芬

（哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025）

Toll樣受體（TLRs）屬于一種模式識別受體（PRPs），在動物免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用，其通過識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）來啟動天然免疫應(yīng)答，達到清除病原微生物及相關(guān)代謝產(chǎn)物的目的。目前已經(jīng)在禽類中發(fā)現(xiàn)10種TLRs（TLR1La/b、TLR2a/b、TLR3/4/5/7/15/21），其中TLR3/4/5/7與哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的TLRs是直系同源物[1-2]。而TLR4作為唯一一種介導(dǎo)MyD88和TRIF兩種信號通路的TLRs家族成員，可以引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致TNFα、IL-6、IL-8和IL-12等細(xì)胞因子的釋放[3-4]。Wang等[5]首次克隆出朗德鵝TLR4基因，全長2641 bp，預(yù)測編碼843個氨基酸，并檢測出在過度喂養(yǎng)條件下，TLR4在皮下脂肪和腸中的表達顯著增加，但在心臟中表達下降。朱道仙等[6]研究證實患痛風(fēng)病的雛鵝腸道內(nèi)菌群發(fā)生變化可激活TLR4/MyD88/NF-κB通路，進而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)使腎臟受損。上述研究提示TLR4在鵝免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。本研究通過生物信息學(xué)的方法分析鵝TLR4蛋白特征，為進一步探索TLR4基因在鵝免疫系統(tǒng)中的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從NCBI中檢索不同物種TLR4基因編碼蛋白質(zhì)序列，朗德鵝（AEC32857.1）、馬崗鵝（AKF02412.1）、綠頭鴨（NP_001297342.1）、蘆花雞（AFK08533.1）、灰山鶉（AGO86772.1）、黑尾原雞（ACR26280.1）、非洲鴕鳥（AKP92940.1）、斑胸草雀（ACN58233.1）、密河鱷（KYO23184.1）、虎斑響尾蛇（XP_039178821.1）、斑馬魚（XP_009292463.1）、鯉魚（XP_018980331.2）。

1.2 試驗方法

通過生物信息學(xué)軟件對朗德鵝TLR4基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能以及進化性進行分析（表1）。

表1 生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)址

2 結(jié)果

2.1 鵝TLR4基本特征

通過ExPASy-ProtParam、ExPASy-ProtScale以及UniProt數(shù)據(jù)庫對朗德鵝TLR4基本理化性質(zhì)、親/疏水性以及亞細(xì)胞定位進行預(yù)測，結(jié)果顯示TLR4基因共編碼843個氨基酸殘基，分子式為C4364H6867N1135O1239S32，理論等電點7.55，親水系數(shù)0.019（＞0）。疏水性最強殘基為亮氨酸（3.611），親水性最強氨基酸殘基為組氨酸（-3.311），疏水性氨基酸殘基相對較多（圖1）。UniProt數(shù)據(jù)庫預(yù)測可以看出鵝TLR4大部分定位于細(xì)胞膜（圖2）。

圖1 鵝TLR4親/疏水性預(yù)測

圖2 鵝TLR4亞細(xì)胞定位

2.2 鵝TLR4基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SignalP-5.0、TMHMM-2.0以及SMART對朗德鵝TLR4進行信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域以及結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示鵝TLR4具有信號肽的可能性為0.8497，剪切位點位于第28和29位殘基之間（圖3），與SMART預(yù)測結(jié)果相似。TMHMM-2.0預(yù)測出2個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖4），第一個跨膜結(jié)構(gòu)域位于第12至第34位殘基之間；第二個跨膜結(jié)構(gòu)域位于第640至662位殘基之間。SMART預(yù)測結(jié)果顯示，TLR4胞外區(qū)具有8個亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-rich repeat,LRR）、1個C端亮氨酸富集區(qū)（Leucine-rich repeat C-terminal damain,LRR_CT）以及胞內(nèi)區(qū)的TIR結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖3 鵝TLR4信號肽預(yù)測

圖4 鵝TLR4跨膜預(yù)測

圖5 鵝TLR4結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3 不同物種間TLR4氨基酸序列的進化性

通過MEGA7分析在NCBI中檢索的不同物種TLR4氨基酸序列的進化性。結(jié)果顯示，朗德鵝與馬崗鵝、綠頭鴨、蘆花雞、灰山鶉、黑尾原雞親緣關(guān)系最近，與非洲鴕鳥、斑胸草雀的親緣關(guān)系較近，而與爬行類和魚類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖6 朗德鵝TLR4氨基酸序列進化樹

2.4 鵝TLR4修飾位點預(yù)測

通過NetNGlyc-1.0和NetPhos-3.1預(yù)測鵝TLR4修飾位點。其中N-糖基化位點存在12個，但位于第626和640位殘基的修飾可信度得分較低，分別是0.3883和0.3824（圖7）。磷酸化位點預(yù)測顯示鵝TLR4存在89個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）61個、蘇氨酸（T）22個、酪氨酸（Y）6個。

圖7 鵝TLR4 N-糖基化位點

2.5 鵝TLR4高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA和I-TASSER預(yù)測鵝TLR4二級、三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示鵝TLR4蛋白由α-螺旋（54.69%）、延展鏈（12.34%）、β-轉(zhuǎn)角（2.58%）以及無規(guī)則卷曲（30.13%）四種結(jié)構(gòu)組成（圖8）。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果可以看出，胞外區(qū)是TLR家族典型馬蹄形結(jié)構(gòu)，純黑色部分為亮氨酸（Leu），大部分位于胞外區(qū)，與SMART預(yù)測的LRR結(jié)構(gòu)域存在于胞外區(qū)結(jié)果相吻合，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可判斷跨膜方式屬于α-螺旋跨膜（圖9）。

圖8 鵝TLR4二級結(jié)構(gòu)

圖9 鵝TLR4三級結(jié)構(gòu)

2.6 鵝TLR4相互作用預(yù)測

通過STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測與鵝TLR4相互作用的蛋白質(zhì)，并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖10）。結(jié)果顯示鵝TLR4與TIRAP、LY96、MYD88、HMGB1以及TRAF6等10種蛋白質(zhì)有相互作用，相關(guān)評分見表2。

表2 TLR4與10種蛋白質(zhì)相關(guān)度評分

圖10 鵝TLR4相互作用預(yù)測

3 討論與結(jié)論

在朗德鵝TLR4蛋白基本理化性質(zhì)分析中可以看出在600～700位殘基之間存在疏水峰值，推測該位置可能為疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，之后的跨膜結(jié)構(gòu)域以及結(jié)構(gòu)域預(yù)測則證實了上述猜測，這也與豬、牛等哺乳動物跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測相吻合[7-8]。在TMHMM-2.0預(yù)測出來的兩個跨膜結(jié)構(gòu)域中，第一個跨膜結(jié)構(gòu)域與SignalP-5.0預(yù)測的信號肽區(qū)域重合，可以判斷該位置并沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，這符合SMART的預(yù)測結(jié)構(gòu)。

TLR4胞外區(qū)具有保守性的結(jié)構(gòu)域LRR，但在三花鵝TLR4胞外區(qū)前321位殘基中有6個LRR[9]，而朗德鵝相同位置的LRR的數(shù)量只有4個，可能是因為106位和205位殘基發(fā)生錯義突變所導(dǎo)致，而在哺乳動物海南地方豬中已經(jīng)證實G7209T或G7781A位點的突變可導(dǎo)致TLR4蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并可能影響LRR的數(shù)量[10]?？梢钥闯鯰LR4基因序列具有多態(tài)性，具體功能是否受到影響還有待進一步探究。但以往研究已經(jīng)證明在鴨中免疫機能會受到TLR4第3外顯子中基因多樣性的影響[11]。

TLR4氨基酸序列進化性分析顯示，TLR4在不同物種間存在一定差異性，與三黃雞TLR4進化性分析相符[12]。其中朗德鵝與馬崗鵝親緣關(guān)系最近，而與同為禽類的非洲鴕鳥、斑胸草雀親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是因地緣關(guān)系所導(dǎo)致，在魚類中與斑馬魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能是斑馬魚和禽類的TLR4相比不僅缺失了識別LPS的能力，同時也缺少了信號肽區(qū)[13-14]。String蛋白互作預(yù)測結(jié)果顯示，TIRAP、LY96、MYD88評分達到了0.999，LY96是協(xié)同TLR4識別其激動劑LPS的重要蛋白[15]，TIRAP是含TIR域的接受子蛋白，其與MYD88、TRIF、TRAM等在TIR下游信號傳導(dǎo)中起著重要作用，MYD88是一種胞質(zhì)銜接蛋白，在實驗中是衡量TLR4表達量的重要參照。

通過生物信息學(xué)分析朗德鵝TLR4蛋白基本特性、修飾位點、進化性以及高級結(jié)構(gòu)特征等，結(jié)構(gòu)符合TLRs家族典型特征，修飾位點多處于胞外功能區(qū)，進化性分析說明不同種生物間TLR4存在著種屬差異性。本分析為研究TLR4的免疫功能以及鵝養(yǎng)殖中抗病育種提供了理論基礎(chǔ)。