馬爾尼菲籃狀菌分泌蛋白的鑒定及功能預(yù)測分析

韋吳迪，王 剛，何錦豪，羅 強(qiáng)，賴菁貞,3，蔣俊俊，葉 力，梁 浩

馬爾尼菲籃狀菌病(Talaromycosis)是一種區(qū)域高發(fā)性機(jī)會性感染性疾病，是我國華南地區(qū)AIDS人群死亡的重要原因[1]。該病發(fā)病隱秘，臨床治療后死亡率依舊高達(dá)30%，且復(fù)發(fā)率高，因此該病的致病病原體——馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei, TM)，已被世界衛(wèi)生組織列入真菌“關(guān)鍵病原體”清單中[2-3]。造成此現(xiàn)象的原因在于TM存在一套免疫逃避策略，而這很可能是通過自身分泌蛋白介導(dǎo)的。研究表明，毒力因子Mp1p蛋白可以抑制宿主巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫逃逸作用[4-5]。因此，深入分析TM分泌蛋白意義重大。然而，目前TM分泌蛋白還沒有得到系統(tǒng)地鑒定，僅停留在基于基因組的預(yù)測層面。

近年來，基于質(zhì)譜技術(shù)的分泌蛋白組學(xué)在病原體毒力蛋白鑒定方面得到廣泛應(yīng)用[6-9]。因此，本研究采用質(zhì)譜技術(shù)對TM分泌蛋白進(jìn)行系統(tǒng)全面的鑒定，結(jié)合生物信息學(xué)手段對TM分泌蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，為后續(xù)TM免疫逃逸相關(guān)研究以及TM病的治療提供科學(xué)依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 TM菌株的來源與培養(yǎng) TM菌株(ATCC18224)購自美國ATCC菌種保藏管理中心。TM接種于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基(PDA)，28 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，用PBS反復(fù)沖洗培養(yǎng)基表面，收集孢子懸液，玻璃棉濾掉真菌絲，獲得孢子濾液，14 000 g離心10 min，棄上清，PBS 洗兩次。分別取108的TM孢子，放入20 mL PDA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)5 d(兩重復(fù))，取上清液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：二硫蘇糖醇(DTT，Sigma/D9163-25G)、尿素(國藥/10023218)、質(zhì)譜級胰酶(Promega/V5280)、碳酸氫銨(Sigma/5330050050)、LC-MS 級乙腈(Thermo Fisher Chemical/A955-4)、LC-MS級甲酸(Thermo Fisher Scientific/A117-50)、丙酮(北京化工廠/11241203810051)。主要儀器包括：EASY-nLCTM 1200 納升級UHPLC(Thermo Fisher/LC140)、Q ExactiveTM HF-X 質(zhì)譜儀(Thermo)、電泳儀(Bio-Rad)、酶標(biāo)儀(Thermo/Multiskan FC)。

1.3 總蛋白提取 每組取20 mL TM培養(yǎng)上清液至超濾管中，14 000 g 離心15 min，丟棄穿透液。將超濾后的樣本重新置于1.5 mL離心管中，加入DB溶液(8 mol/L尿素、100 mmol/L TEAB，pH8.5)用于平衡蛋白溶液，再加入濃度10 mmol/L DTT 于56 ℃反應(yīng)1 h，之后加入足量IAM，于室溫避光反應(yīng)1 h[10-12]。

1.4 蛋白酶解 取蛋白樣品，加入DB 蛋白溶解液補(bǔ)足體積至100 μL，加入胰酶和100 mmol/L TEAB 緩沖液，混勻后于37 ℃酶切4 h，再加入胰酶和CaCl2酶切過夜。加入甲酸調(diào)節(jié)pH 小于3，混勻后于室溫、12 000 g 離心5 min，取上清緩慢通過C18 除鹽柱，之后使用清洗液連續(xù)清洗3 次，再加入適量洗脫液，收集濾液，凍干。

1.5 質(zhì)譜檢測 配制流動相A 液(100%水、0.1%甲酸)和B 液(80%乙腈、0.1%甲酸)。使用 A 液溶解1 μg樣品進(jìn)樣(0.1 mg/mL)，液質(zhì)檢測。使用EASY-nLCTM 1200 納升級UHPLC 系統(tǒng)和Q ExactiveTM HF-X 質(zhì)譜儀進(jìn)行二級質(zhì)譜檢測，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)(.raw)。

1.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 根據(jù)UniPort蛋白數(shù)據(jù)庫使用搜庫軟件Proteome Discoverer 2.2(PD2.2，Thermo)搜索全部的結(jié)果譜圖[13]。為了提高分析結(jié)果質(zhì)量，PD2.2 軟件對檢索結(jié)果進(jìn)一步過濾：可信度在99%以上的譜肽(Peptide Spectrum Matches，PSMs)為可信PSMs，至少包含一個unique 肽段(特有肽段)的蛋白為可信蛋白，只保留可信的譜肽和蛋白，并做FDR 驗(yàn)證，去除FDR大于1% 的肽段和蛋白。

1.7 生物信息學(xué)分析 利用GO[13]和KEGG[14]數(shù)據(jù)庫對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋，以了解不同蛋白質(zhì)的功能特性。使用Cell-mPLOC 2.0網(wǎng)站[15]預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息。使用SignalP網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[16]預(yù)測所鑒定蛋白的信號肽序列及其切割位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜鑒定的TM分泌蛋白 本實(shí)驗(yàn)取兩個獨(dú)立重復(fù)樣本進(jìn)行分泌蛋白鑒定，共鑒定出分泌蛋白43個，其中樣本一為31個，樣本二為33個。對兩個樣本的結(jié)果取交集，得到21個分泌蛋白(圖1)，具體的分泌蛋白組分見表1。

表1 鑒定的TM分泌蛋白詳細(xì)信息

圖1 兩個樣本的TM分泌蛋白數(shù)量

2.2 鑒定的TM分泌蛋白的分子量和pI分布 本研究中鑒定的TM分泌蛋白分子量最低的為17.0 kDa(A0A5Q0PGZ4，核苷二磷酸激酶)，分子量最高的為169.1 kDa(A0A5Q0PT05，Septin型G結(jié)構(gòu)域蛋白)，平均分子量為50.0 kDa(圖2A)。本項(xiàng)研究的鑒定蛋白的pI值在5.03(A0A5Q0PBN9，該蛋白還未鑒定)到9.32(A0A5Q0PHS7，肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶)之間，平均值為6.69(圖2B)。

圖2 鑒定出的TM分泌蛋白的分子量(A)和pI(B)分布

2.3 TM分泌蛋白功能注釋 GO分析顯示，TM分泌蛋白主要參與超氧化物代謝、壓力應(yīng)對、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原過程和DNA復(fù)制等生物學(xué)過程；主要的分子功能涵蓋核酸結(jié)合、金屬離子結(jié)合、水解酶活性等；蛋白質(zhì)的細(xì)胞組分主要為細(xì)胞核、質(zhì)膜和MCM復(fù)合體等(圖3A)。而亞細(xì)胞定位分析顯示，TM分泌蛋白主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞外、質(zhì)膜、線粒體和細(xì)胞膜等(圖3B)。

圖3 TM分泌蛋白GO功能富集(A)和亞細(xì)胞定位(B)注釋圖

2.4 TM分泌蛋白通路富集 KEGG通路富集分析顯示，TM分泌蛋白主要參與遺傳信息、代謝以及生物系統(tǒng)通路。遺傳信息通路為核酸折疊、分類和降解；代謝通路包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔助因子代謝、維生素代謝和核苷酸代謝；生物系統(tǒng)通路包括環(huán)境適應(yīng)和免疫系統(tǒng)通路。見圖4。

圖4 TM分泌蛋白KEGG通路富集注釋圖

2.5 TM分泌蛋白信號肽及剪切位點(diǎn)分析 用SignalP網(wǎng)站預(yù)測所鑒定蛋白的信號肽序列及其切割位點(diǎn)，結(jié)果顯示，僅有6個蛋白(A0A5Q0PEB7、A0A5Q0PMA9、A0A5Q0PPZ5、A0A5Q0PS50、A0A5Q0PYY6和A6NAD8)存在信號肽序列，其N端序列以及剪切位點(diǎn)信息如表2所示。

表2 TM分泌蛋白的信號肽及剪切位點(diǎn)信息

3 討 論

病原體分泌蛋白在其感染致病過程中發(fā)揮著重要作用，研究表明結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌等可以通過分泌蛋白抑制宿主免疫殺傷作用，促進(jìn)自身在巨噬細(xì)胞的存活和增值[17-19]。然而，國內(nèi)外對馬爾尼菲籃狀菌的分泌蛋白組研究甚少，目前僅對毒力因子Mp1p的研究較為深入。因此，本研究通過質(zhì)譜技術(shù)，構(gòu)建了TM的分泌蛋白譜，共定性了21個分泌蛋白。生物信息學(xué)分析顯示，TM分泌蛋白在真菌代謝、環(huán)境適應(yīng)和免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。

根據(jù)GO富集結(jié)果顯示，TM分泌蛋白主要參與超氧化物代謝(超氧化物歧化酶)、壓力應(yīng)對(Septin型G結(jié)構(gòu)域蛋白)和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)(鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)等生物學(xué)過程，這可能與TM感染介導(dǎo)的免疫逃逸和侵染宿主細(xì)胞有關(guān)。超氧化物歧化酶已經(jīng)被證明是多種病原體的毒力因子，作為一種抗氧化酶，超氧化物歧化酶具有較強(qiáng)的抗炎反應(yīng)，能夠下調(diào)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子、ROS等[20-21]。Septin蛋白作為一種細(xì)胞支架蛋白，可調(diào)控病原體的出芽、分裂等生理過程，同時在多種細(xì)菌侵入、感染宿主過程中扮演重要角色[22]。研究表明，金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是真菌重要的毒力因子，涉及真菌致病性的多個方面[23]。本研究中鑒定的鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已被證明是新型隱球菌毒力的重要調(diào)控因子[24]，但是該蛋白在TM中發(fā)揮何種作用，還需進(jìn)一步研究。

Mp1p蛋白是目前研究較為明確的TM毒力因子，與超氧化物歧化酶類似，Mp1p也是一種抗炎物質(zhì)，目前已知的機(jī)制是通過與花生四烯酸(AA)結(jié)合，從而抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[4-5]。本次研究中我們在TM分泌蛋白也鑒定出Mp1p，佐證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。然而，在本研究鑒定的21種蛋白中，有5種蛋白在數(shù)據(jù)庫中未能找到相應(yīng)注釋(Uncharacterized protein)，這表明TM分泌蛋白具有較大的研究潛力。其他16種蛋白除了Mp1p外，其余均未得到深入的研究。

信號肽是蛋白質(zhì)N-末端一段疏水性氨基酸序列，用于引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的短肽鏈。蛋白質(zhì)到達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)位置后，信號肽會被信號肽酶進(jìn)行切除，其中真菌的信號肽酶為一型信號肽酶(SPaseI)，SignalP便是基于以上原理對分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測。本研究預(yù)測結(jié)果顯示，僅有6種蛋白質(zhì)存在信號肽，這提示分泌蛋白并不是都通過信號肽的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明，真菌分泌蛋白可通過多種途徑轉(zhuǎn)移至胞外，包括與分泌小泡結(jié)合或進(jìn)入內(nèi)體亞小室、被動運(yùn)輸、膜翻轉(zhuǎn)和膜易位等[25]。有趣的是，預(yù)測結(jié)果顯示有部分分泌蛋白定位到細(xì)胞核、質(zhì)膜、線粒體和細(xì)胞膜等位置，其分泌至胞外發(fā)揮何種生物學(xué)作用尚未明確，因此，未來還需要對TM分泌蛋白進(jìn)行更深入的功能研究。值得注意的是，本研究使用質(zhì)譜技術(shù)所鑒定的蛋白可能存在一定的假陽性，且分泌蛋白的功能分析也僅基于生物信息學(xué)推測所得，因此，未來還需使用體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物學(xué)手段進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突：無

引用本文格式：韋吳迪，王剛，何錦豪，等.馬爾尼菲籃狀菌分泌蛋白的鑒定及功能預(yù)測分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(1)：19-24.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.170