我國(guó)主要沿海地區(qū)O1群霍亂弧菌分子分型特征分析

柳婷婷，李 萍，楊文輝，金大智，高 姍，王 菁，王景林，康 琳，辛文文

霍亂弧菌(Vibriocholerae)屬于革蘭陰性菌，普遍存在于不同的水生環(huán)境中。根據(jù)其主要表面耐熱抗原O，目前霍亂弧菌可分為近200多種血清群[1]，其中O1群和O139群能夠產(chǎn)生霍亂毒素(Cholera Toxin，CT)，是引起霍亂的病原菌。O1血清群可進(jìn)一步分為3種血清型——小川型(Ogawa)、稻葉型(Inaba)和彥島型(Hikojima)[2]。

霍亂是人類感染了產(chǎn)毒素的霍亂弧菌而引起的急性水樣腹瀉病，暴發(fā)突然且易傳播，死亡率高，屬于國(guó)際檢疫傳染病[3]。病原菌分子分型是追溯霍亂傳染源，調(diào)查傳播途徑的主要手段?；魜y弧菌有許多種血清型，不同血清型的細(xì)菌，生理生化特性可能相同，但是對(duì)人類和動(dòng)物的致病性可能完全不同。因此，對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行快速分型具有重要意義。目前以核酸序列差異分析為主的分子分型手段對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行分型與進(jìn)化的研究是較為先進(jìn)且最為靈敏準(zhǔn)確的，主要方法包括腸桿菌基因間重復(fù)一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC)PCR[4]、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)及多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)技術(shù)等[5]。MLST技術(shù)能夠在無(wú)細(xì)菌純培養(yǎng)物的情況下，直接從臨床樣本中擴(kuò)增出特定位點(diǎn)基因片段進(jìn)行分析，直觀反映等位基因的變異情況，并且能夠?qū)崿F(xiàn)全球范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)交流共享。隨著基因組測(cè)序成本的降低，目前正處于從MLST到全基因組測(cè)序分型的過渡階段[6]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物的鑒定[7]。MALDI-TOF MS具有亞型區(qū)分的潛力，是研究菌株親緣關(guān)系、確定暴發(fā)菌株和地域特征間密切關(guān)聯(lián)的有力工具[8]。目前，MALDI-TOF MS對(duì)多血清型細(xì)菌的鑒定和分類仍處于起步階段，如對(duì)副溶血弧菌O3群等均表現(xiàn)出較好的分型能力[9]，在對(duì)艱難梭菌基因型ST37的表征區(qū)分[10]、流行性霍亂弧菌O1/O139群與非流行性霍亂弧菌[11]的快速區(qū)分也表現(xiàn)出了良好的效果，但是在其他物種的應(yīng)用上可能會(huì)受限制，需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

本研究利用MLST分型方法鑒定192株霍亂弧菌的MLST分型，進(jìn)而分析其種群結(jié)構(gòu)。此外，利用MALDI-TOF MS技術(shù)分析霍亂弧菌蛋白指紋圖譜的相關(guān)性，并對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。部分MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的O1群菌株也納入研究體系中，以進(jìn)行相關(guān)的比較分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)采用的霍亂弧菌核酸和滅活蛋白來(lái)自863計(jì)劃項(xiàng)目(課題編號(hào)：2014AA021402)參與單位浙江省疾病預(yù)防控制中心，其中大部分屬于O1血清群，包括Inaba 63株、Ogawa 125株。其余4個(gè)菌株沒有相關(guān)血清型信息。

1.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)提供的方案，選擇adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM和pyrC這7個(gè)管家基因作為靶基因進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括正向和反向引物各0.5 μL(30 pmol/mL)、0.5 μL 10 mmol/L dNTP、5μL 10× Buffer(500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%TritonH X-100及15 mmol/L MgCl2)、2U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)和5 μL模板DNA，加ddH2O至總體積為50 μL。PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s、56 ℃ 50 s、72 ℃ 80 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。使用PCR引物在ABI-3700測(cè)序儀上對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行雙向測(cè)序，并使用Contig-Express進(jìn)行比對(duì)。使用Bioedit和MUSCLE version 3.8等軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和比較分析。對(duì)于16S rDNA，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包含正向和反向引物各1 μL、12.5 μL的2×Taq PCR master Mix、2 μL模板DNA，加ddH2O至總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s、50 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 霍亂弧菌基因組7個(gè)等位基因MLST擴(kuò)增引物

1.3 MALDI-TOF MS分析的樣品制備 首先使菌體蛋白(約10 mg)完全懸浮于300 μL ddH2O中，然后加入900 μL無(wú)水乙醇吹吸均勻，進(jìn)行滅菌；12 000 r/min離心2 min后去除上清液(盡可能去除干凈)；向沉淀中加入50 μL 70%的甲酸，使菌體蛋白完全懸浮后再加入50 μL乙腈，充分混勻后12 000 r/min離心2 min；取1 μL上清液進(jìn)行靶板點(diǎn)樣，并在室溫下干燥。樣本干燥后立即向樣本上覆蓋2 μL的α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid, CHCA)并在室溫下干燥形成共結(jié)晶，后續(xù)即可上機(jī)分析。

1.4 序列多樣性分析 使用DnaSP 5.0計(jì)算7個(gè)等位基因的多樣性指數(shù)π、G+C含量及單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)個(gè)數(shù)。使用KaKs Calculator Version 2.0計(jì)算非同義和同義突變的比值dN/dS。

1.5 等位基因多樣性分析 將7個(gè)等位基因序列按照adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM、pyrC的順序拼接在一起，將拼接序列結(jié)果與霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定其等位基因型(Allelic Profile, AP)和序列型(Sequence Type, ST)。新的AP和ST提交到PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)。依據(jù)序列型的等位基因信息，使用eBURST Version 3.0對(duì)STs進(jìn)行分析，歸類為克隆群(Clonal Complex, CC)。CC包含至少3個(gè)基因位點(diǎn)不同的STs，7個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)及以上位點(diǎn)相同則定義為遺傳相關(guān)克隆。

1.6 種群結(jié)構(gòu)分析 利用STRUCTURE 2.2，采用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)算法，分別分析評(píng)估本試驗(yàn)得到的22個(gè)STs和40個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的O1/O139群相關(guān)STs。計(jì)算種群內(nèi)群體數(shù)量K值，各個(gè)序列型間依據(jù)同源性高低而確定群體歸屬。本研究中，K值設(shè)置范圍為2～10，每100 000次重復(fù)并棄去前20 000次不穩(wěn)定結(jié)果。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 使用MUSCLE 3.8.31比對(duì)O1血清群的22個(gè)STs和40個(gè)STs的連接序列，并通過MEGA 5.0對(duì)獲得的核酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析(1 000次重復(fù))，構(gòu)建無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹。利用SplitsTree 4.0軟件，采用Neighbour-net算法構(gòu)建16S rDNA序列的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖，檢驗(yàn)種群間是否存在重組現(xiàn)象。

1.8 MALDI-TOF MS圖譜生成和聚類分析 采用正線性模式，每種菌株采集4～5張復(fù)合圖譜，每張復(fù)合圖譜由6張單圖譜組成。通過基線減法和平滑處理進(jìn)行預(yù)處理。將屬于同一ST的分離株的蛋白指紋圖譜進(jìn)行疊加，使用BioTyper 3.0軟件(Bruker Daltonics)中的PCA算法進(jìn)行蛋白指紋圖譜分析，以便分析不同ST之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 核苷酸位點(diǎn)和等位基因序列多樣性 7個(gè)等位基因的遺傳多樣性結(jié)果如表2所示。等位基因型最多的是metE，共11個(gè)，最少的是purM，有3個(gè)。位于II號(hào)染色體上的pntA和pyrC均有10個(gè)等位基因型。pyrC共含有84個(gè)SNPs，顯示出最高的遺傳多樣性，其次是metE，含有58個(gè)SNPs。purM是最保守的基因，只有3個(gè)SNPs，且π是7個(gè)管家基因中最低的。pyrC的π水平最高，為0.060 58。除了pntA存在正選擇效應(yīng)外，其余等位基因均受到自然純化作用。

表2 核苷酸和等位基因序列多樣性

2.2 序列類型和克隆群 本研究22個(gè)STs中11個(gè)為新鑒定的ST。ST69為最主要的序列型，192株菌株中82株為ST69，其次是ST75，有40個(gè)菌株。新鑒定出的STs中，ST176包含的菌株數(shù)最多，有5個(gè)菌株。

圖1A顯示的是22個(gè)STs之間單等位基因位點(diǎn)變異關(guān)系(即7個(gè)等位基因中，至少有6個(gè)等位基因型相同)。22個(gè)STs形成2個(gè)CCs，均包含5個(gè)STs。CC176包含的5個(gè)STs分別是ST171、ST172、ST173、ST176和ST177，其中ST176為該CC的founder。CC430包含的5個(gè)STs分別是ST164、ST165、ST174、ST430和ST431，ST430為該CC的founder。剩下的12個(gè)STs形成了3個(gè)雙體和6個(gè)單體，ST69與ST75被分到兩個(gè)不同的雙體中。在對(duì)霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中O1/O139血清群對(duì)應(yīng)的40個(gè)STs進(jìn)行分析時(shí)，ST69與ST75分別形成了CC。CC69包含ST69、ST70和ST429，CC75包含ST75、ST169、ST170和ST182(圖1B)。圖1C顯示的是與數(shù)據(jù)庫(kù)中非O1/O139血清群STs的單等位基因位點(diǎn)變異關(guān)系，本研究中22個(gè)STs以紅色圓圈標(biāo)出。結(jié)果顯示，所有STs共形成6個(gè)CCs，分別為CC430、CC176、CC270、CC204、CC8和CC499。本研究中的22個(gè)STs未與數(shù)據(jù)庫(kù)中非O1/O139群對(duì)應(yīng)的STs形成新的克隆群。

注：彼此為單等位基因位點(diǎn)變異的ST用黑線連接。黑色圓點(diǎn)的大小與每個(gè)ST內(nèi)的菌株數(shù)量有關(guān)，圓點(diǎn)越大數(shù)量越多。每個(gè)CC的名稱用紅色標(biāo)出。

2.3 霍亂弧菌的系統(tǒng)發(fā)育和蛋白指紋圖譜分析 使用MEGA 5.0構(gòu)建鄰接(Neighbor joining, NJ)樹(圖2A)以分析本研究中22個(gè)STs與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中O1/O139群對(duì)應(yīng)的40個(gè)STs之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。22個(gè)STs形成2個(gè)譜系，ST169、ST75、ST429和ST69聚集在一個(gè)譜系中，其他18個(gè)STs在另一個(gè)譜系中。數(shù)據(jù)庫(kù)中40個(gè)STs之間的關(guān)系也分為2個(gè)譜系，2個(gè)譜系中都包含本試驗(yàn)的22個(gè)STs(數(shù)據(jù)未顯示)。

采用neighbour-net方法，根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建了各個(gè)STs間分支網(wǎng)狀圖，如圖2B所示。192個(gè)菌株共含有13種不同的16S rDNA序列，其中8種序列包含1株以上的分離株和ST型。13種不同的序列中，4種序列都包含ST173，說(shuō)明ST173分離株對(duì)應(yīng)的16S rDNA序列具有多樣性。此外，不同的16S rDNA序列存在共有的ST，如ST69、ST75和ST173。

A：采用最大似然法計(jì)算22個(gè)STs間的進(jìn)化距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，新的ST用紅色圓點(diǎn)標(biāo)出；B：采用neighbour-net算法計(jì)算192株霍亂弧菌的16S rDNA序列與22個(gè)STs間的關(guān)系，并繪制成分支網(wǎng)狀圖，ST后括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示屬于同一ST的分離株數(shù)。

圖3A顯示了分別屬于22個(gè)STs的分離株的蛋白指紋圖譜的膠圖。不同STs的圖譜基本相同，質(zhì)量峰(m/z)均在2 000～12 500 Da范圍內(nèi)。另外，采用BioTyper 3.0對(duì)本研究中的22個(gè)STs的蛋白指紋圖譜的相關(guān)性也進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3B所示。當(dāng)距離為200時(shí)，22個(gè)STs被分為2組，較大的組包含除ST171外的21個(gè)STs。當(dāng)距離為100時(shí)，22個(gè)STs被分成3組，ST179又形成了一個(gè)單獨(dú)的組。蛋白指紋圖譜分析結(jié)果與核苷酸序列分析結(jié)果不存在明顯相關(guān)性。

A：22個(gè)STs的蛋白指紋圖譜膠圖。相同ST的分離株圖譜疊加，視為1株分離株；B：根據(jù)22個(gè)STs的蛋白指紋譜生成的聚類分析樹狀圖，屬于相同ST的分離株視為1株分離株。

2.4 種群結(jié)構(gòu) 利用LDhat評(píng)估了霍亂弧菌7個(gè)等位基因的重組率(rho)與突變率(theta)，每個(gè)基因的重組率(purM除外)如表3所示。它們的比率范圍從0.31(gyrB)到388.52(adk)不等，7條序列總體比率為4.24。對(duì)于本研究中22個(gè)STs而言，在進(jìn)化過程中，重組比突變更容易發(fā)生。此外，對(duì)霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的屬于O1/O139血清群的40個(gè)STs，及所有霍亂弧菌的364個(gè)STs分析發(fā)現(xiàn)，包含所有STs的組的rho高于致病血清群STs的rho，平均重組率為863.46，而另外兩組的重組率均<1。IA值均>0，表明在a、b、c 3個(gè)組中均存在連鎖不平衡的傾向(表4)。

表3 各基因的重組檢測(cè)和評(píng)估

表4 各種群基因的重組檢測(cè)和評(píng)估

采用STRUCTURE 2.2進(jìn)一步分析種群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)22個(gè)STs被分成3個(gè)亞群，即K=3(圖4A)。ST69、ST429、ST75和ST169主要存在于第I組(紅色組)中，與第II組(綠色組)和第III組(黃色組)存在少量交叉。第II組包含11個(gè)STs，其中8個(gè)STs是本研究中新發(fā)現(xiàn)的，第III組中包含3個(gè)新發(fā)現(xiàn)的STs。圖4A中第I組(紅色組)包含的4個(gè)STs在圖4B中同樣也分布在同一組(黃色組)。圖4A中其余18個(gè)STs在圖4B中分布在同一個(gè)組(紅色組)。值得注意的是，圖4B中黃色組位于紅色組的中間，并將紅色組分為2個(gè)部分，表明黃色組在紅色組別間形成了“亞克隆群”。ST189、ST191和ST184存在2個(gè)不同組別間(綠色組和紅色組)的重組現(xiàn)象。為進(jìn)一步分析O1群對(duì)應(yīng)的STs和非O1/O139群對(duì)應(yīng)的STs間的種群結(jié)構(gòu)關(guān)系。我們也對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的STs進(jìn)行了種群結(jié)構(gòu)分析(圖4C)。結(jié)果顯示，所有的STs共形成4個(gè)亞群，絕大部分的STs都存在于紅色組，紫色和綠色對(duì)應(yīng)的亞群穿插在紅色組中，黃色組被紅色組分為距離較遠(yuǎn)的2個(gè)部分。本研究中的22個(gè)STs全部存在于紅色組。

A：本研究中22個(gè)STs的種群結(jié)構(gòu)圖；B：數(shù)據(jù)庫(kù)中40個(gè)O1/O139血清群對(duì)應(yīng)的STs構(gòu)建的種群結(jié)構(gòu)圖；C：數(shù)據(jù)庫(kù)中STs構(gòu)建的種群結(jié)構(gòu)圖。不同的顏色代表不同的種群。

3 討 論

霍亂弧菌是霍亂的病原菌，通常會(huì)引起成人和兒童急性腹瀉疾病，是我國(guó)甲類腸道傳染病。目前已經(jīng)有許多針對(duì)霍亂弧菌O1血清群分離株的研究[12]，本研究選擇MLST方法來(lái)評(píng)估192株O1群霍亂弧菌的遺傳多樣性。MLST計(jì)算的是管家基因核酸位點(diǎn)的變化，不受操作條件的干擾，可實(shí)現(xiàn)最大的數(shù)據(jù)共享?；魜y弧菌已建立了MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(www.pubmlst.org/vcholerae)，并且已有很多學(xué)者利用該方法對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行研究。此外，MALDI-TOF MS可以作為一種潛在的亞型區(qū)分方法區(qū)分大腸桿菌O157、O26和O111與其他血清型[13]，不過在某些物種的應(yīng)用上也會(huì)受限制[14]。

本研究中的菌株大多屬于血清型Inaba或Ogawa，Ogawa是最普遍的血清型。O1群的另一種血清型Hikojima較罕見且不穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)最保守的基因是purM，變化最大的基因是pyrC，這一結(jié)果與其他菌株的研究一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)7個(gè)管家基因在進(jìn)化過程中，重組比突變更容易發(fā)生，尤其是adk基因的比率為388.52，遠(yuǎn)高于其他研究中非O1/O139菌株的比率[12]?；魜y弧菌非O1/O139群與O1/O139群在系統(tǒng)發(fā)育上關(guān)系較遠(yuǎn)[15]。類似研究結(jié)果也表明，非O1/O139群霍亂弧菌對(duì)應(yīng)的STs常形成單體，種群內(nèi)部存在異質(zhì)性[16]。本研究中，O1群對(duì)應(yīng)的STs與數(shù)據(jù)庫(kù)中非O1/O139群對(duì)應(yīng)的STs未能形成新的克隆群，且絕大部分非O1/O139血清群對(duì)應(yīng)的STs如星星狀散在分布，與上述研究結(jié)果相似。

ST69是第7次霍亂大流行分離株中的主要ST。類似的研究結(jié)果也表明，絕大部分O1/O139臨床菌株都是ST69[17]，但含有不同的毒力基因性狀，這可能是基因水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致[18]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)多地主導(dǎo)的ST 69被ST75所取代[19-20]。非O1/O139菌株比O1/O139菌株表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性，可能是由基因重組和/或突變引起[12]。ST69印度毒株與全球毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，ST69與ST429密切相關(guān)[21]，ST429由ST71突變而來(lái)。本研究的16S rDNA序列的Neighbor-net網(wǎng)狀分析結(jié)果表明，不同的16S rDNA序列存在共有的ST，如ST69、ST75和ST173，我們猜測(cè)這3個(gè)STs在新ST演變過程中起著重要作用。目前已有一些研究利用MALDI-TOF MS技術(shù)從蛋白指紋圖譜角度對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行分析。Telesmanich等[22]證明MALDI-TOF MS可以區(qū)分霍亂弧菌O1和非O1/O139菌株，并且可以分析它們的來(lái)源和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于本研究收集的菌株血清群?jiǎn)我?所有菌株都屬于O1血清群)且地域環(huán)境相似，獲得的蛋白指紋圖譜聚類分析結(jié)果與核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果間未發(fā)現(xiàn)明顯聯(lián)系，下一步我們將豐富菌株血清型和地域信息，已獲得更加全面的霍亂弧菌種群結(jié)構(gòu)信息。

總之，本研究通過MLST對(duì)我國(guó)沿海地區(qū)192株O1群霍亂弧菌的分子分型特征分析發(fā)現(xiàn)，ST69和ST75是O1群霍亂弧菌最主要的2個(gè)ST，管家基因重組比突變更容易發(fā)生，O1/O139群和非O1/O139群霍亂弧菌間存在較大差異，另外利用MALDI-TOF MS技術(shù)的分型研究有待進(jìn)一步探究。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：柳婷婷，李萍，楊文輝，等.我國(guó)主要沿海地區(qū)O1群霍亂弧菌分子分型特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(1)：10-18.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.177