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    三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測純培養(yǎng)物和環(huán)境水體中霍亂弧菌方法的建立及應(yīng)用*

    2013-10-16 03:44:04麻麗丹王殿夫王多春曹際娟
    關(guān)鍵詞:霍亂弧菌弧菌探針

    麻麗丹,王殿夫,王多春,曹際娟

    (1.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧 丹東,118000;2.遼東學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,遼寧 丹東,118000;3.國家疾控中心腹瀉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,102206;4.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧 大連,116001)

    霍亂是一種急性腸道傳染病,對一些亞洲和非洲國家來說目前仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,霍亂弧菌主要通過受污染的水和食物傳播,與不嚴(yán)格的環(huán)境管理密切相關(guān)。因此,加強(qiáng)霍亂弧菌環(huán)境水體監(jiān)測,可提供環(huán)境污染危險(xiǎn)性的評價(jià)及對傳播來源的分析,為制定霍亂防控對策提供科學(xué)依據(jù),是霍亂防治工作的重要組成部分,同時(shí),對環(huán)境水體的霍亂弧菌的監(jiān)測可作為霍亂流行的預(yù)警指標(biāo)[1-4]。水體中的霍亂弧菌檢測通常是采用傳統(tǒng)的濃縮堿性蛋白胨增菌法。國家衛(wèi)生部編制的《霍亂防治手冊》及GB15984-1995《霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》首選方法也是此法(以下簡稱常規(guī)法)。但在霍亂的非流行期,霍亂弧菌在外環(huán)境水體中自然生存狀態(tài)下菌量較少,同時(shí)由于外環(huán)境水體中存在大量其它雜菌,會(huì)對霍亂弧菌的分離鑒定產(chǎn)生干擾;另外,霍亂弧菌可以以活的非可培養(yǎng)及生物膜狀態(tài)存在,常規(guī)培養(yǎng)無法檢測到,對監(jiān)測技術(shù)研發(fā)提出了更高的要求。并且研究顯示,非O1群和非O139群霍亂弧菌也能引起霍亂的爆發(fā),造成在疫情監(jiān)測和調(diào)查中產(chǎn)生誤差,不適應(yīng)烈性傳染病的監(jiān)測需要[5-12]。

    針對這些不足,為了提高外環(huán)境水體中霍亂弧菌的檢出率,減少漏檢的可能性,在確保標(biāo)本采集和增菌的技術(shù)質(zhì)量前提下,作者將實(shí)時(shí)熒光PCR(real time fluorecent PCR)運(yùn)用于對霍亂弧菌的快速篩選。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測是近幾年發(fā)展起來的PCR技術(shù),具有快速、特異、敏感的特點(diǎn),可對樣品進(jìn)行精確定量。本研究以霍亂弧菌(O1群和O139群)O抗原編碼基因(rfb)和特異性的溶血素基因(hlyAA)序列為靶序列[13-14],建立三重實(shí)時(shí)熒光 PCR的實(shí)驗(yàn)方法,為水體標(biāo)本霍亂弧菌的初篩與純培養(yǎng)物鑒定提供了一條可行的途徑。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

    霍亂弧菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株N16961(O1群)、MO45(O139群)、O1群 El Tor型霍亂弧菌30株(2002—2008年分離),O139群霍亂弧菌5株(2003—2006年分離),非O1/非O139群霍亂弧菌25株(2007—2008年分離)以及O22和N53、以及擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥?zhǔn)匣【⒑踊【?、?chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、嗜水氣單胞菌等8種環(huán)境水體中能分離到的弧菌。實(shí)驗(yàn)菌株均經(jīng)過血清或生化鑒定,本室保存。

    1.2 引物和探針的設(shè)計(jì)

    根據(jù)O1群和O139群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb序列和霍亂弧菌特異性的溶血素基因(hlyA)序列,使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)并合成針對O1群和O139群特異性rfb和霍亂弧菌特異性的溶血素基因(hlyA)的PCR引物和探針(見表1)。

    表1 實(shí)時(shí)熒光PCR所用引物和探針Table 1 Primers and probes for real-time fluorecent PCR assay

    1.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

    將N16961、O22和MO45標(biāo)準(zhǔn)菌株于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間,測OD600nm值估計(jì)細(xì)菌數(shù),將菌液倍比稀釋到10-7,取10-4、10-5、10-6、10-7菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù),各稀釋度重復(fù)3個(gè),按照相應(yīng)的方法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)取平均值確定其真實(shí)的菌密度。同時(shí)每個(gè)稀釋液各取1mL菌液于2mL離心管中并作3管重復(fù),用于提取DNA測其OD260nm/OD280nm值并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,確定反應(yīng)體系的靈敏度。

    1.4 單重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件

    實(shí)時(shí)熒光PCR采用20μL反應(yīng)體系,每個(gè)反應(yīng)中含10μL通用 PCR 反應(yīng)預(yù)混液(TaqMan Gene Expression Master Mix(2×),ABI 產(chǎn) 品);引 物 對(10μmol/L)各0.4μL、探針(10μmol/L)0.2μL、滅菌蒸餾水7μL、模板2μL。反應(yīng)條件為第一步:預(yù)變性,進(jìn)行1個(gè)循環(huán):95℃10min;第二步:PCR反應(yīng) 共40個(gè)循環(huán),95℃15s;60℃1min。

    1.5 三重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件

    實(shí)時(shí)熒光PCR采用20μL反應(yīng)體系,每個(gè)反應(yīng)中含10μL 通用 PCR 反應(yīng)預(yù)混液(TaqMan Gene Expression Master Mix(2×),ABI產(chǎn) 品)、O1 引 物 對(20μmol/L)各 0.25 μL、O1 探 針 (20 μmol/L)0.125μL、O139引物對(20μmol/L)各1μL、O139探針(20μmol/L)0.5μL 、hlyA 引物對(20μmol/L)各0.5μL、hlyA 探針(20μmol/L)0.4μL、滅菌蒸餾水3.15μL、模板2μL。反應(yīng)條件為第一步:預(yù)變性,進(jìn)行1個(gè)循環(huán):95℃10min;第二步:PCR反應(yīng) 共40個(gè)循環(huán),95℃15s;60℃1min。

    1.6 河口水標(biāo)本的檢測和霍亂弧菌的分離

    2007年3月~2008年6月間,對丹東市區(qū)的鴨綠江河段及其入??谔?,采集水體標(biāo)本共計(jì)252份。每份采集450mL,回實(shí)驗(yàn)室后加入50mL 10倍濃縮的堿性蛋白胨增菌液,置37℃增菌6h,取其中1mL提取細(xì)菌DNA(ABI公司)做模板,按實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件檢測O1、O139、非O1和非O139群霍亂弧菌,另分別取10μL涂TCBS平板分離霍亂弧菌,對生長的可疑菌落進(jìn)行O1群及O139群霍亂診斷血清玻片凝集試驗(yàn)和霍亂弧菌生化試驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 靈敏度分析

    采用 N16961(O1 群;1.9×107cfu/mL)、MO45(O139群;2.2×107cfu/mL)、O22(非O1/O139群;1.7×107cfu/mL)進(jìn)行靈敏度和定量實(shí)驗(yàn)研究,實(shí)時(shí)熒光PCR可檢測出至10-6,對應(yīng)的菌落數(shù)分別為19cfu/mL、22cfu/mL和 17cfu/mL。定量關(guān)系式分別為:y=-3.122 9 x+37.814,R2=0.998 8;y=-3.206 6 x+41.526,R2=0.995;y= -3.657 7 x+40.882,R2=0.996 6。式中x分別表示O1群霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)、O139群霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)和O22霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù),y表示CT值。靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果和定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1~3。

    圖3 O22群霍亂弧菌定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Quantity amplified curve for Vibrio cholerae O22serogroups assay

    2.2 特異性分析

    用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR分別檢測不同年代分離、不同型別的霍亂弧菌DNA(31株O1群、27株非O1/O139群和5株O139群)以及其它水體中能分離出的8種常見弧菌。分別進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測O1群、O139群霍亂弧菌和所有血清型的霍亂弧菌,均表現(xiàn)出了100%的特異性。當(dāng)模板中同時(shí)存在O1群、非O1/O139群和O139群DNA時(shí),采用三重實(shí)時(shí)熒光PCR法時(shí)3種目的片段均獲得擴(kuò)增(見圖4),并且結(jié)果互不干擾,并且能夠與其它弧菌和細(xì)菌相區(qū)別。說明O1群、O139群特異性rfb基因和霍亂弧菌特異性的溶血素基因(hlyA)共同檢測時(shí)特異性高,沒有交叉反應(yīng)和干擾現(xiàn)象。

    圖4 霍亂弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線Fig.4 Specific amplified curve for Vibrio cholerae three multiplex Real-Time Fluorescent PCR

    2.3 水體標(biāo)本的檢測

    本研究在丹東市鴨綠江水體的市區(qū)河段以及入??谔幉杉怂w進(jìn)行霍亂弧菌的監(jiān)測,對252份水體樣本進(jìn)行霍亂弧菌的增菌后分離,同時(shí)用建立的O1群、非O1/O139群和O139群霍亂弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測增菌液DNA。常規(guī)分離菌株份數(shù)為14份O1群、149份非O1/O139群和2份O139群,而利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,陽性份數(shù)為29份O1群、165份非O1/O139群和6份O139群。其中,所有常規(guī)分離方法陽性的標(biāo)本,其實(shí)時(shí)PCR檢測也均為陽性,同時(shí)血清群檢測結(jié)果也一致。

    表2 三重實(shí)時(shí)熒光PCR對水體標(biāo)本中霍亂弧菌的檢測Table 2 Vibrio cholerae detected by three multiplex Real-Time Fluorescent PCR in Water samples

    3 討論

    熒光定量PCR已被應(yīng)用于檢測水體環(huán)境中的霍亂弧 菌 等 病 原 菌[15-17],Lyon 等[14]采 用 溶 血 素 基 因(hlyA)做探針,使用TaqMan PCR法檢測O1群、O139群以及非O1群和非O139群霍亂弧菌,獲得較高的靈敏度。本研究建立了基于熒光探針的實(shí)時(shí)熒光PCR法,用于水體增菌標(biāo)本中快速檢測O1群、O139群、非O1和非O139群霍亂弧菌的方法,檢測的目標(biāo)基因是O1群和O139群霍亂弧菌的O抗原特異的rfb基因片段和霍亂弧菌特異性的溶血素基因(hlyA)為靶序列,如果擴(kuò)增出hlyA基因片段而未檢出O1群和O139群霍亂弧菌,則可認(rèn)為檢出非O1和非O139群霍亂弧菌。實(shí)時(shí)熒光PCR法具有高特異性和高靈敏度并且快速可用于水體中霍亂弧菌的篩選。

    本研究顯示,對標(biāo)本第一次增菌液使用商品化試劑盒提取DNA標(biāo)本,對于一份樣品,從DNA提取到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測時(shí)間在2h以內(nèi),由于不需要對擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分離,因此縮短了對樣品的檢測周期。另外實(shí)時(shí)熒光PCR比分離培養(yǎng)有明顯的高靈敏性,因此在處理標(biāo)本時(shí),可以先進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,然后僅對陽性標(biāo)本的增菌液進(jìn)行后續(xù)分離鑒定,這樣能夠明顯增加監(jiān)測工作中處理的標(biāo)本量,從而明顯提高監(jiān)測工作的靈敏性和工作效率。需注意的是水體中常能檢測到霍亂弧菌,但在非流行期,環(huán)境中常能檢到非產(chǎn)毒的霍亂弧菌,這類菌株有報(bào)道能引起輕微的腹瀉。

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