活血益氣方對裸鼠抑瘤作用及大鼠急性毒性實驗研究*

陳 菲，馮英楠，王海征，王曉萌，張 鵬，林曉蘭

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100053

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤［1］。由于浸潤性生長，手術(shù)難以切除干凈，放療不敏感，化療藥物容易產(chǎn)生耐藥，因此治療效果不理想。中藥因多靶點作用在腫瘤治療中占有重要地位［2］。醫(yī)院制劑活血益氣方抗瘤丸（簡稱KLW）是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的純中藥復(fù)方制劑。臨床使用近40年，安全有效，價格低廉。課題組前期進行的荷瘤裸鼠實驗與小鼠最大耐受量試驗證明該藥有效安全，但是膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)腫瘤，在治療時有特殊位點依賴性，故本研究采用裸鼠熒光顱內(nèi)模型研究KLW的顱內(nèi)抑瘤作用，更貼近臨床實際，為KLW的進一步應(yīng)用、研究、開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠，6～9周齡［北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；動物合格證號：SCXK（京）2016-0006］；裸小鼠BALB/c，18～22 g［北京華阜康生物科技股份有限公司；動物合格證號：SCXK（京）2014-0004］。

1.2 藥物供試品醫(yī)療機構(gòu)制劑KLW（京藥制字Z20063103，宣武醫(yī)院提供）。

1.3 試劑與儀器胎牛血清（FBS BI 1545515）、DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen Corporation 1177237）、胰蛋白酶（GIBCO 903931）、水合氯醛。NAPCO 6500型CO2培養(yǎng)箱；CLASS TYPE B2型生物安全柜；eppendorf centrifuge 5430R型臺式離心機；INDEC BioSystems Fluor Vivo 300型熒光成像儀；Leica MZ16型熒光顯微鏡；Leica DM3000型倒置顯微鏡；PB602-N型電子天平；TE2101-L型電子天平。

1.4 方法

1.4.1 裸鼠抑瘤實驗

1.4.1.1 裸鼠荷瘤顱內(nèi)模型建立 取源自同系小鼠皮下的U87-RFP膠質(zhì)瘤組織，在解剖顯微鏡下切除壞死組織并將膠質(zhì)瘤組織切成1 mm3大小均一的組織塊。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠后，無菌手術(shù)條件下，運用外科原位接種技術(shù)，將切好的膠質(zhì)瘤組織塊種植到實驗小鼠顱內(nèi)并縫合，建立紅色熒光蛋白標記的人類腦膠質(zhì)瘤（U87-RFP）小鼠原位模型。模型建立后第1天用熒光成像儀對所有小鼠腦膠質(zhì)瘤進行非侵襲性實時成像觀察。剔除瘤負荷偏離均值較大的荷瘤小鼠后將其余小鼠隨機分為陰性對照組及高、低濃度KLW組各6只。陰性對照組給予溶媒，KLW各劑量組分別予高、低濃度KLW［3.4、6.8 g/kg（體質(zhì)量）］，給藥26天。

1.4.1.2 一般行為學(xué)和體質(zhì)量檢測 每天觀察小鼠狀況，每周稱體質(zhì)量2次。瘤體熒光面積：通過Fluor Vivo Model100成像系統(tǒng)觀察實驗小鼠膠質(zhì)瘤負荷情況，每周2次。

瘤質(zhì)量：給藥26天后常規(guī)注射戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，解剖剝離原位腦膠質(zhì)瘤，并稱重。腫瘤抑制率：

IR（%）=（1-治療組瘤質(zhì)量/對照組瘤質(zhì)量）×100%

1.4.2 大鼠急性毒性試驗

1.4.2.1 分組與給藥 將SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為陰性對照組和KLW組各20只。KLW組灌胃給藥每日2次，間隔約4 h，單次給藥容積為15 mL/kg（體質(zhì)量）KLW 0.44 g生藥/mL。陰性對照組飲用純凈水。

1.4.2.2 檢測指標 給藥后每天上、下午觀察動物臨床癥狀1次，連續(xù)觀察14天；給藥前后每周測體質(zhì)量2次。大體剖檢死亡大鼠和實驗結(jié)束后所有存活動物，剖檢病變器官，進行組織病理學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，進行方差齊性檢驗及單因素方差分析及Dunnett-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 顱內(nèi)模型抑瘤實驗

2.1.1 行為學(xué)觀察 灌胃后各組小鼠每4天稱體質(zhì)量1次，最后1次稱量為給藥第24天，各組小鼠無臥伏無自主活動減少等現(xiàn)象；給藥期間，各組小鼠無明顯消瘦，一般狀況未見明顯異常，食欲正常。給藥18天后各組小鼠體質(zhì)量均有下降趨勢。小鼠全部存活且組間比較無顯著性差異，見圖1。

圖1 給藥期間各組裸鼠體質(zhì)量變化曲線

2.1.2 瘤體熒光面積 灌胃后每4天讀取各組小鼠顱內(nèi)腫瘤熒光面積1次，最后1次讀數(shù)為給藥第24天。實驗結(jié)束時低劑量組祼鼠顱內(nèi)腫瘤熒光面積讀數(shù)較陰性對照組縮?。s縮小35%），高劑量組明顯小于陰性對照組和低劑量組（約縮小44%），并且高、低劑量組與陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，具有明顯的量效關(guān)系。見圖2—3。

圖2 各組U87-RFP膠質(zhì)瘤整體原位熒光成像圖

圖3 各組裸鼠顱內(nèi)腫瘤面積生長曲線

2.1.3 瘤體質(zhì)量 實驗結(jié)束時，低、高劑量組腫瘤質(zhì)量與陰性對照組比較明顯減小，其中高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示KLW對人源腦膠質(zhì)瘤小鼠原位模型具有一定抑制作用，且該作用呈明顯的量效關(guān)系。見表1及圖4。

表1 各組裸鼠瘤體質(zhì)量比較

圖4 各組裸鼠顱內(nèi)瘤體質(zhì)量平均值

2.1.4 腫瘤抑制率 低劑量組IR（%）=（1-低劑量組瘤體質(zhì)量平均值/陰性對照組瘤體質(zhì)量平均值）×100%=（1-0.1828/0.2217）×100%=18%，高劑量組IR（%）=（1-高劑量組瘤體質(zhì)量平均值/陰性對照組瘤體質(zhì)量平均值）×100%=（1-0.1080/0.2217）×100%=51%，低劑量組腫瘤抑制率低于高劑量組。

2.2 大鼠急性毒性試驗

2.2.1 臨床癥狀與體質(zhì)量 陰性對照組與KLW組大鼠一般狀態(tài)良好，未見明顯臨床癥狀，試驗期間無大鼠死亡。兩組體質(zhì)量基本一致。

2.2.2 病理學(xué)檢查 所有存活動物未見明顯大體病理學(xué)改變。單次灌胃13.2 g生藥/kg（體質(zhì)量）KLW后大鼠未見明顯臨床癥狀，體質(zhì)量未見明顯異常，未見明顯大體病理學(xué)改變。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為腫瘤發(fā)生的病理機制多由于人體正氣不足，感受毒邪所致［2］。KLW具有清熱解毒，活血化瘀，化痰散結(jié)功效。北京軍區(qū)總醫(yī)院、天津醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、北大一院等多中心臨床試驗結(jié)果顯示［3］，抗瘤粉對153例腦膠質(zhì)瘤的平均有效率為64.7%?；仡櫺匝芯勘砻鳎?］，院內(nèi)制劑KLW可以延長惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時間。前期課題組研究證明KLW能夠抑制裸鼠腋下移植膠質(zhì)瘤模型的瘤生長［5］，其機制與抑制膠質(zhì)瘤細胞C6、U87、U251的增殖作用［6-9］及上調(diào)Bax表達，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比例增加，促進細胞凋亡有關(guān)［10-11］。

血腦屏障是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病面臨的最大阻礙，化療藥物不僅難以透過其進入腫瘤組織，且易誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生耐藥性，致使療效不理想。藥物能否在腦內(nèi)聚集達到足夠劑量和產(chǎn)生相應(yīng)的治療作用，一直是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的關(guān)鍵。本研究采用人源膠質(zhì)瘤U87建立裸鼠顱內(nèi)模型，同時，用熒光標記膠質(zhì)瘤細胞造模，能夠通過熒光成像儀實時監(jiān)測腫瘤生長情況，并通過熒光面積讀數(shù)得到腫瘤生長曲線。

本研究結(jié)果顯示，KLW對于人源膠質(zhì)瘤顱內(nèi)移植模型裸鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤具有一定抑制作用。低、高劑量組能夠縮小熒光面積，減輕腫瘤質(zhì)量，腫瘤抑制率分別為18%、51%，其中高劑量組與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，服藥期間裸鼠一般行為學(xué)無改變。急性毒性試驗結(jié)果顯示，灌胃最大容積最大濃度的KLW后大鼠未見明顯異常，提示KLW大鼠具有較高的安全性。