非標記定量蛋白質組學技術探討不同透析齡患者腹膜透析流出液外泌體差異蛋白的研究

武云慧，黃抱娣，茅春霞，李歸雁，邢昌贏，張 莉*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，2營養(yǎng)科，江蘇 南京 210029

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是終末期腎臟病患者廣泛使用的腎臟替代治療方式之一，PD的全球年增長率約為8%，已高于血液透析的增長率（約6%～7%）［1］。隨著透析時間的延長，腹膜結構和功能受損，限制了治療并導致患者的不良結局。相關機制尚不明確，其中人腹膜間皮細胞的上皮?間充質轉化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）被認為是核心環(huán)節(jié)，EMT是上皮特征的逐步丟失和肌成纖維細胞樣表型的獲得［2］。腹膜活檢仍然是識別腹膜病理改變的金標準，由于不易重復檢查，并且存在創(chuàng)傷風險，在臨床上難以推廣。因此，尋找早期識別腹膜損傷的無創(chuàng)性生物標志物，指導個性化干預，能夠延長患者的PD時間。

外泌體是一類直徑為30～150 nm 的細胞外囊泡，可由多種細胞分泌，包裹著蛋白質、脂質、DNA和RNA 等物質，介導細胞間的信號轉導，這些物質幾乎參與了所有的生理和病理過程，可作為液體活檢的重要標志物進行疾病診斷與治療［3-4］。雖然研究證明腹膜透析流出液（peritoneal dialysis effluent，PDE）中存在外泌體［5］，但對PDE來源外泌體所攜帶的蛋白質研究卻少有報道。最新研究表明，PDE 中通過外泌體釋放的水通道蛋白1 與腹膜超濾效率相關，可能是評估腹膜完整性的一種潛在生物標志物［6］。本研究通過非標記定量蛋白質組學技術對不同透析齡患者PDE 外泌體蛋白進行鑒定和定量分析，篩選差異蛋白，通過生物信息學分析差異蛋白功能及生物學過程，尋找腹膜損傷的生物標志物及探討發(fā)病機制提供了參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2020 年5—7 月于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腹膜透析中心行穩(wěn)定PD 治療并規(guī)律隨訪的患者。透析方案為持續(xù)性非臥床腹膜透析（continu?ous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD）或日間非臥床腹膜透析（daytime ambulatory peritoneal dialysis，DAPD）。排除標準：①年齡＜18 歲或＞80 歲；②PD＜1個月；③惡性腫瘤或嚴重創(chuàng)傷患者；④自身免疫性疾病患者；⑤有肝炎、肝纖維化或結核病史患者；⑥1 個月內(nèi)發(fā)生過腹膜炎癥或其他嚴重感染患者。根據(jù)透析齡分為兩組：初始腹透組（newly enrolled pa?tients group，NEP組）（1個月≤透析齡≤2個月）；維持腹透組（maintenance peritoneal dialysis patients group，MPD組）（24個月≤透析齡≤28個月）。最后，納入NEP組和MPD組各5例患者，收集這些患者的一般臨床資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（審批文號：2020?SR?294），并獲得患者的知情同意。

SDS（上海生工），尿素（Bio?Rad 公司，美國），Tris（上海生工），HCl（北京國藥），BCA 定量試劑盒（上海碧云天），30 kDa 超濾離心管（Sartorius 公司，德國），IAA（Sigma 公司，美國），胰蛋白酶（Promega公司，美國），Anti?CD63 抗體（Ab216130）、Anti?TSG101 抗體（Ab125011）（Abcam 公司，美國），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（A0208，上海碧云天），C18Cartridge（Waters 公司，美國），低速離心機（湖南Cence TDZ5?WS），超速離心機（Himac CP80WX，德國），透射電子顯微鏡（FEI，Tecnai G2 Spirit，美國），納米顆粒跟蹤分析儀（Particle Metrix，ZetaView PMX 110，德國），電泳系統(tǒng)（Bio?Rad 公司，美國），Multiskcan FC 酶標儀、高效液相色譜儀（EASY?nLC System，美國）、質譜系統(tǒng)（Q?Exactive，Thermo Fisher Scientific公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 外泌體的分離

收集每例患者行腹膜平衡試驗前1 d 100 mL留腹過夜的PDE，放入4 ℃預冷離心機，于300g離心10 min、2 000g離心10 min 去除死細胞后，取上清液轉移至超速離心機配套的離心管中，在4 ℃下10 000g離心30 min 去除細胞碎片，100 000g離心70 min，取透明沉淀，并分別用磷酸鹽緩沖液（phos?phate buffer solution，PBS）1 055、1 015、1 015 μL 重懸，-80 ℃保存以備下一步檢測。

1.2.2 外泌體的鑒定

取15 μL樣品在電鏡測試的銅網(wǎng)上室溫下靜置1 min，濾紙吸去浮液，加入15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色1 min，沉淀后吸去殘液，白熾燈下烤10 min，TEM觀察樣本中有形物體的形態(tài)和大??；取2 μL樣品置于新的離心管中，用PBS 稀釋至1 mL，混勻后緩慢注入納米顆粒跟蹤分析儀中，進行粒徑和濃度分析；免疫印跡法檢測外泌體標志蛋白CD63 和TSG101，根據(jù)檢測出的蛋白濃度，將樣品原液稀釋至所需的上樣量，SDS?PAGE 電泳，轉PVDF 膜。用5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，分別加入單克隆抗體CD63、TSG101（均按照1∶1 500稀釋），4 ℃搖床孵育1 h，TBST清洗，再分別加入山羊抗兔IgG二抗（均按照1∶5 000 稀釋），室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST 清洗，加入ECL發(fā)光液顯影后采集圖像。

1.2.3 蛋白的提取和酶解

取樣品加入適量SDT裂解液（4%SDS，100 mmol/L Tris?HCl），沸水浴15 min 后，14 000g離心15 min，提取上清液中的蛋白。BCA 法測定蛋白質濃度。各樣品取20 μg，行SDS?PAGE 電泳，考馬斯亮藍染色。蛋白樣品取80 μg，分別加入50 mmol/L DTT還原，沸水浴5 min，用200 μL UA（8 mmol/L 尿素，150 mmol/L Tris?HCl）混勻，通過重復超濾除去洗滌劑、DTT 和其他低分子量組分。再加入100 μL IAA避光反應30 min，依次用100 μL UA、25 mmol/L NH4HCO3清洗過濾器。加入40 μL 胰蛋白酶，37 ℃放置16 h，離心收集酶解上清液。采用C18Cartridge對肽段進行脫鹽，真空凍干，-20 ℃保存。

1.2.4 質譜數(shù)據(jù)采集

在與Easy?nLC 系統(tǒng)偶聯(lián)的Q?Exactive 質譜儀上，采集液相色譜?串聯(lián)質譜（LC?MS/MS）數(shù)據(jù)。配制流動相A 液（100%水、0.1%甲酸）和B 液（80%乙腈、0.1%甲酸）。色譜柱以100%的A液平衡，取2 μg樣品進樣，液質檢測，液相色譜洗脫條件（表1）。使用Q?Exactive質譜儀，檢測方式為正離子，質譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，全掃描范圍為350～1 800 m/z，一級質譜分辨率設為70 000，C?trap 最大容量為3×106，最大注入時間為50 ms，每次全掃描后采集10個碎片圖譜；二級質譜檢測中，分辨率設為17 500，AGC target 為2×105，最大注入時間為45 ms，碎裂碰撞能量設為27%，生成質譜檢測原始數(shù)據(jù)。

表1 液相色譜洗脫條件Table 1 Liquid chromatography elution conditions

1.2.5 蛋白的鑒定和定量分析

MaxQuant 是基于質譜的蛋白質組學數(shù)據(jù)分析最常用的平臺之一，集成了多種算法用于高分辨率的定量質譜數(shù)據(jù)集［7］。Uniprot是目前國際上有關蛋白質信息最全面的非冗余數(shù)據(jù)庫，具有豐富蛋白質序列和注釋數(shù)據(jù)資源［8］。本研究產(chǎn)生的質譜原始文件導入MaxQuant軟件（版本號1.6.14.0）進行處理，并通過數(shù)據(jù)庫Uniprot_HomoSapiens_20367_20200226 檢索鑒定，所得文件采用Perseus 1.3 軟件以差異倍數(shù)＞2或＜0.5且P＜0.05為標準篩選差異蛋白。

1.2.6 生物信息學分析

Blast2GO 數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異表達蛋白進行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集；京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫軟件進行通路分析。STRING和Cytoscape工具分析蛋白互作網(wǎng)絡。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（）表示，兩組間差異比較用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較用Mann?WhitneyU檢驗；計數(shù)資料組間比較采用Fisher精確概率檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較

本研究共納入10 例PD 患者，NEP 組和MPD 組男女比均為3/2，兩組患者在透析齡方面差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在年齡、高血壓、糖尿病、透析方案、腹膜平衡試驗（peritoneal equilibration test，PET）值、估計腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、尿素清除指數(shù)（urea clearance index，Kt/V）方面差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05，表2）。

表2 不同透析齡患者一般臨床資料比較Table 2 Comparison of general clinical data of patients with different dialysis ages

2.2 PDE外泌體的鑒定

電鏡下觀察到茶托狀的雙層膜包裹的圓形囊泡，NTA對囊泡的粒徑分析結果顯示，大多數(shù)囊泡直徑分布在30～150 nm，免疫印跡結果顯示利用超速離心得到的細胞外囊泡存在外泌體的標志蛋白CD63 和TSG101。證明從PDE中提取到外泌體（圖1）。

圖1 腹透流出液中外泌體鑒定Figure 1 Identification of exosomes in peritoneal dialysis effluent

2.3 蛋白鑒定和定量分析結果

根據(jù)色譜分析及數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定出499 種蛋白。通過定量分析，共篩選出32 種差異表達蛋白，較NEP 組相比，17 種蛋白在MPD 組表達上調（表3），15種蛋白在MPD組表達下調（表4）。

表3 MPD組/NEP組上調差異蛋白Table 3 MPD group/NEP group up?regulated differential protein

表4 MPD組/NEP組下調差異蛋白Table 4 MPD group/NEP group down?regulated differential protein

2.4 生物信息學分析結果

2.4.1 差異蛋白GO功能的富集分析

對差異蛋白進行GO 功能分析，結果顯示主要參與對結合的正向調控、氧化應激反應、過氧化物酶反應、離子轉運、胱甘肽結合反應等重要的生物學過程，分子功能則以結合與催化活性為主，如雙鏈RNA 結合、谷胱甘肽轉移酶活性、電壓門控離子通道活性、氯離子通道活性等，同時還與氯離子通道復合物、細胞膜、細胞核基質區(qū)域、肌漿網(wǎng)、肌球蛋白復合物等細胞組分密切相關（圖2）。

圖2 GO功能富集分析Figure 2 GO function enrichment analysis

2.4.2 KEGG通路富集及差異蛋白互作分析

將組間PDE 外泌體差異蛋白進行互作網(wǎng)絡分析（圖3）。結果表明，鑒定到的PDE外泌體中有23個差異蛋白參與復雜調控網(wǎng)絡，提示具有較好的生物學關聯(lián)。KEGG 通路分析表明，共發(fā)現(xiàn)8 個有統(tǒng)計學意義的代謝通路，分別是IL?17信號通路、Th17細胞分化通路、吞噬體通路、植物?病原體相互作用、孕激素介導的卵母細胞成熟、前列腺癌、沙門氏菌感染、抗原處理和遞呈相關通路，差異蛋白在吞噬體通路富集的蛋白數(shù)目最多（圖4）。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡分析Figure 3 Protein interaction network analysis

圖4 KEGG信號通路富集分析Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

PDE 代表了一種特別有吸引力的非侵入性臨床樣本，在透析液中浸泡的腹膜組織能夠分泌或脫落一些物質，這些流出物有助于監(jiān)測腹膜狀態(tài)，更好地了解腹膜環(huán)境信息［5］。蛋白質是細胞和生物體功能的直接執(zhí)行者，蛋白質組學近年來得到了飛躍發(fā)展，對生命科學領域方面的探索具有重要意義。本研究所使用的非標記技術優(yōu)勢在于不需核素標記，方法簡便，可對多個臨床樣本分析，并提供了大量蛋白豐度的差別信息，已逐漸成為重要的蛋白質組學定量分析方法［9］。

PDE 中含有大量血漿蛋白，如白蛋白和免疫球蛋白，這可能掩蓋了其他豐度較低但相關性較高的蛋白，如細胞因子和趨化因子，干擾了質譜鑒定［10］。外泌體是細胞間信息交流、物質傳遞的載體，既攜帶起源細胞內(nèi)成分，又排除了高豐度雜質蛋白的干擾，為尋找特異性標志物提供了新思路。本研究通過對初始腹透組與維持腹透組的PDE 外泌體進行蛋白質組學比較，共篩選出17 種上調蛋白和15 種下調蛋白。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，若能及早監(jiān)測到PDE 外泌體攜帶蛋白質的改變，這些信息將有可能幫助監(jiān)測腹膜損傷，維持腹膜的最佳功能。

細胞內(nèi)氯離子通道（chloride intracellular chan?nel，CLIC）蛋白家族是由6個進化保守的蛋白組成：CLIC1～6，以可溶性和膜結合性兩種狀態(tài)存在，并已被證明在細胞運動調節(jié)［11］、細胞凋亡［12］及小管生成［13］等多種過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，CLIC 在線粒體損傷產(chǎn)生的活性氧誘導下能夠遷移到細胞膜上，介導胞內(nèi)氯離子外流，促進NLRP3 炎癥小體組裝、Caspase?1激活和IL?1β分泌［14］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)CLIC1-/-小鼠的腹腔巨噬細胞表現(xiàn)出吞噬體酸化缺陷、蛋白水解能力受損和活性氧產(chǎn)生減少［15］。本研究外泌體中攜帶的CLIC蛋白可能參與了腹膜改變中的慢性炎癥反應，并且因PD 時間延長而表現(xiàn)為上調，通過調節(jié)CLIC活性可考慮作為開發(fā)抗炎藥物的合適靶點。

嗜酸性粒細胞過氧化物酶（eosinophil peroxi?dase，EPX）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是由炎癥部位活化的免疫細胞所釋放的含血紅素的酶，除參與對病原微生物的氧化防御機制外，在刺激成纖維細胞遷移、血管生成和促進細胞外基質合成中也發(fā)揮著重要作用［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)，由煙曲霉菌引起的肺曲霉菌病中，除中性粒細胞外，嗜酸性粒細胞缺乏會影響肺部對煙曲霉菌的防御。正常小鼠煙曲霉菌暴露后激發(fā)誘導CD11b+SinglecF+Ly?6GloLy?6CnegCCR3+嗜酸性粒細胞募集在肺部，伴隨EPX mRNA 水平的升高。轉錄因子dblGATA1 缺乏的小鼠則顯示嗜酸性粒細胞的選擇性缺乏，表現(xiàn)煙曲霉菌清除受損和肺內(nèi)病變［18］。隨著透析時間的延長，PD 導管及透析液的長期刺激，機體免疫狀態(tài)發(fā)生改變，本研究EPX在PDE外泌體中表達明顯下降，可能與腹膜損傷加重有關。另有研究報道，結直腸癌干細胞信號活躍（Snail+IL8+）的大腸癌患者腫瘤中MPO+中性粒細胞浸潤增加，提示中性粒細胞參與介導EMT和結直腸癌干細胞小生境，預示著患者生存不良［19］。在PD患者PDE外泌體中MPO的升高可能與上皮?間質穩(wěn)態(tài)失衡相關。針對異常早期嗜酸性粒細胞和中性粒細胞激活策略可能被開發(fā)用于對抗腹膜損傷。

非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（myosin?9，MYH9）屬于肌球蛋白超家族，參與肌動蛋白纖維運動、骨架重組、細胞?細胞間黏附和蛋白轉運等過程［20］。研究發(fā)現(xiàn)，干擾MYH9 可影響脂多糖刺激小膠質細胞釋放外泌體。脂多糖可通過增加外泌體濃度，提高CD9和CD81蛋白陽性標記率和表達率，從而增強小膠質細胞的外泌體釋放，將MYH9 siRNA 轉染后會降低釋放的外泌體濃度和粒徑［21］。MYH9 在長期PD患者PDE外泌體中表達異常，可能是介導外泌體釋放所需的潛在靶點。

熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）是一類三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）依賴的分子伴侶，促進蛋白質折疊，參與蛋白質穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)展等過程［22］。研究表明，轉移性口腔癌來源的細胞外囊泡富集HSP90α、HSP90β和癌癥起始細胞標志物CD326/EpCAM，顯著促進了口腔癌細胞的遷移、侵襲和體外腫瘤起始，靶向這些分子的三重siRNA 顯著降低了分子伴侶的水平并減弱了EMT，逆轉了細胞外囊泡驅動的惡性腫瘤事件［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP90α、HSP90β在PD 患者PDE 外泌體中出現(xiàn)的差異性表達，可能與機體參與應激反應相關，是否能對腹膜改變進行判斷和評估尚需要做進一步研究。

鋅結合α2?糖蛋白（zinc?alpha?2?glycoprotein，AZGP1）是由脂肪細胞和上皮細胞合成的一種糖蛋白，在參與脂肪分解和能量消耗中有重要影響［24］。研究發(fā)現(xiàn)，AZGP1在非結核分枝桿菌肺病的乳腺癌患者的血清外泌體中明顯表達，可能通過調節(jié)免疫功能和觸發(fā)脂解增強易感性，有利于對疾病的風險評估和監(jiān)測［25］。這一發(fā)現(xiàn)與本研究PDE 外泌體中AZGP1表達上調趨勢一致，其水平可能與脂質代謝相關，需進一步驗證。

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutro?phil gelatinase?associated lipocalin，LCN2）是一種急性時相反應蛋白，屬于lipocalin超家族，在急性腎損傷中可能提供了對感染的必要保護［26］。既往研究報道，LCN2 在炎癥狀態(tài)和腎小管上皮細胞損傷時表達增加，被認為是預測腎小管損傷的新型生物標志物，與急性腎損傷、糖尿病腎病等多種腎臟疾病密切相關［27-28］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，LCN2 蛋白在PD患者PDE 外泌體中表達升高，長期PD 引起過多炎癥介質釋放，造成腹膜間皮細胞損傷，進而影響腹膜功能，LCN2的升高可能與機體保護作用有關。

本研究在吞噬體通路富集的蛋白數(shù)目最多，吞噬過程作為重要的天然免疫防護機制，對維持機體穩(wěn)態(tài)至關重要。從吞噬體產(chǎn)生，經(jīng)過與溶酶體融合、酸化等一系列變化，最終降解抗原或殺死病原微生物的過程稱為吞噬體成熟［29］。該成熟過程涉及蛋白質組成的變化，蛋白質組學已經(jīng)成為吞噬體成熟研究的重要工具［30］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在強直性脊柱炎病變髖關節(jié)的蛋白質組中，MPO被認為是參與吞噬體通路的關鍵蛋白，體外實驗也進一步證實了上調的MPO 可能通過吞噬體通路促進成纖維細胞的炎癥反應［31］。

通過比較不同透析齡患者PDE 外泌體差異蛋白，發(fā)現(xiàn)與IL?17 信號通路、Th17 細胞分化通路、吞噬體通路等密切相關，Th17 細胞介導的炎癥反應，特別是細胞因子IL?17，已經(jīng)被證明在腹膜損傷中起著關鍵作用［32］。PDE 外泌體中兩個階段差異蛋白的觀察可能為PD相關腹膜損傷提供新的數(shù)據(jù)。PD是將腹膜透析液導入到患者腹腔中進行物質交換的人為操作技術，考慮其高滲、高糖和低pH等外源性因素刺激腹膜組織占主導作用，本研究共收集單中心一段時間內(nèi)就診的10 例PD 患者，年齡不匹配所出現(xiàn)的差異可能與初始腹透組患者整體年齡偏低，維持腹透組因腹透時間長而出現(xiàn)整體年齡偏高相關。本研究存在不足之處，包括樣本量小，及其觀察性和橫斷面性質，后續(xù)可通過擴大樣本量來改進，使得年齡差異更小，并進一步探討不同年齡段PDE 中外泌體蛋白的差異和評估其用于臨床監(jiān)測的實用性。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的差異蛋白可能作為PD 患者腹膜損傷的候選標志物，也為揭示腹膜纖維化分子生物學機制提供線索。