lncRNA在骨質(zhì)疏松中作用的初步研究

李北辰，徐芳蓉，楊崇正，劉 衡，孫 強*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院脊柱外科，江蘇 南京 210006；2南京醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)系，江蘇 南京 211166

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是由于多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性疾?。?-2］。OP 引起的骨折人數(shù)的增加及其相關(guān)發(fā)病率給公共衛(wèi)生服務(wù)行業(yè)帶來了沉重負(fù)擔(dān)［2-3］。因此，尋找有效的OP預(yù)防和治療策略，在目前仍是一個關(guān)鍵問題。

在多種因素的調(diào)節(jié)下，骨形成和骨吸收的過程保持動態(tài)平衡，以維持骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。一方面，眾多信號通路參與到骨平衡中，如Wnt/β?FGF、PI3K?Akt及BMPs/Smads等信號通路。另一方面，非編碼RNA 的表觀遺傳調(diào)節(jié)也在骨平衡中發(fā)揮重要作用。長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）參與各種人類疾病的生物學(xué)過程［4-5］。lncRNA在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平廣泛參與，可以順式或反式作用的方式調(diào)節(jié)組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、蛋白質(zhì)功能活性及RNA代謝［6-7］。所以，發(fā)掘出關(guān)鍵的信號通路和有意義的lncRNA，可以為診斷和治療OP提供新視角。

本課題組通過利用GEO數(shù)據(jù)庫，對GSE35956基因芯片進行分析，使用富集分析和lncRNA重注釋的方法，發(fā)掘出其中關(guān)鍵的信號通路和lncRNA RAD51?AS1。而且，通過細(xì)胞學(xué)實驗驗證RAD51?AS1 促進增殖及成骨的能力，對RAD51?AS1 改善OP 進行了初步研究，為未來OP的診治提供新思路［8］。

1 材料和方法

1.1 材料

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從正常人及確診OP 的志愿者的骨髓血提取。所有的骨髓血取下后立即置于完全培養(yǎng)基中，并及時提取其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)至第2 代后提取樣本的總RNA。本課題研究通過了南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會的同意，并得到了所有取樣患者的知情同意。

培養(yǎng)細(xì)胞的α?MEM培養(yǎng)基、TRIzol 試劑及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美國）；Ul?traGRO（上海Helios BioScience公司）；逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR試劑盒（南京諾唯贊公司）；lncRNA RAD51?AS1的Smart Silencer（廣州銳博公司）；MTT（Biofroxx公司，德國）；ALP染色試劑盒（上海碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 lncRNA重注釋及生物信息學(xué)分析

GSE35956 數(shù)據(jù)集使用了Affymetrix HG ?U133Plus 2.0 微陣列，包括54 675 個探針組。根據(jù)既往文獻，對基因芯片進行l(wèi)ncRNA 重注釋，以確定映射到lncRNA 的探針集。首先，從Affymetrix 網(wǎng)站下載了HG?U133 Plus 2.0 微陣列探針注釋，以過濾具有Refseq ID 的探針集，標(biāo)記為“NR_”或“XR_”。第二，將GSE35956 矩陣與上述文件中的探針I(yè)D 結(jié)合起來。第三，利用Genecode 數(shù)據(jù)庫將步驟2 文件與有基因名的注釋文件相結(jié)合。最后，總共選擇了特定的1 228 個有注釋的lncRNA 轉(zhuǎn)錄物和相應(yīng)的Affymetrix 探針I(yè)D［9］。微陣列分析GSE35956原始數(shù)據(jù)從GEO 數(shù)據(jù)庫下載（GSE35956）。數(shù)據(jù)微陣列的背景校正和歸一化由R 語言的AffyR 包處理。此外，在歸一化表達的基礎(chǔ)上，用R 軟件生成特異的1 228 個lncRNA表達矩陣。mRNA 和lncRNA 差異基因表達分析由DEseq2 R包進行。使用ggplot R軟件包在dif?lncRNA 上繪制火山圖。使用ClusterPro?filer 對mRNA 差異分析的基因進行富集分析。

1.2.2 細(xì)胞提取和培養(yǎng)

從骨髓中吸取骨髓血后立即加入無菌的α?MEM 進行運輸。無菌條件下使用密度梯度離心法分離出人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞需要培養(yǎng)在含有5%UltraGRO 的α?MEM 培養(yǎng)基中，貼壁生長；同時根據(jù)需求是否添加雙抗（100 mg/L鏈霉素和100 U/mL）。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含有5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每3～4 d更換新的培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞融合度達到80%～90%時，按1∶2 或1∶3的比例進行細(xì)胞傳代。后續(xù)使用正常人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞繼續(xù)功能試驗。

1.2.3 實時定量PCR

提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的總RNA，根據(jù)美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的基因序列，設(shè)計并合成lnc?RNA RAD51?AS1 和內(nèi)參ACT?β的引物。RAD51?AS1上游引物：5′?TGATCCTGCGCGAGTTTACA?3′，下游引物：5′?ATGCATGCCGGGAGATGTAG?3′；ACT?β上游引物：5′?TCTCCCAAGTCCACACAGG?3′，下游引物：5′?GGCACGAAGGCTCATCA?3′。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL，其中包括：ddH2O 7.2 μL、上游引物（10 μmol/L）0.4 μL、下游引物（10 μmol/L）0.4 μL、SYBR Green 10.0 μL及模板cDNA 2.0 μL，每個樣本設(shè)置2～3個復(fù)孔。反應(yīng)條件：第1階段對cDNA進行預(yù)變性，在PCR 中95 ℃，30 s；第2 階段進行循環(huán)反應(yīng)進行擴增，在95 ℃下10 s，60 ℃下30 s，循環(huán)40 次；最后階段對最終產(chǎn)物進行熔解曲線測量，95 ℃下15 s，60 ℃下60 s 和95 ℃下15 s。基因表達分析是通過2-ΔΔCT方法計算的。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

lncRNA RAD51?AS1 的Smart Silencer 以用于干擾RAD51?AS 的表達，其中使用無酶超純水對RNA干粉進行稀釋。Lipofectamine 3000和100 nmol/L的Smart Silencer 在1 個試管中孵化，轉(zhuǎn)染15 min。轉(zhuǎn)染6～8 h后，更換新的細(xì)胞完全生長培養(yǎng)基，待培養(yǎng)至24～72 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.5 MTT實驗

①將轉(zhuǎn)染24～36 h 的細(xì)胞消化下并計數(shù)，每孔3 000 個細(xì)胞；②待細(xì)胞貼壁完全后，每孔加入濃度為5 mg/mL 的MTT 工作液20 μL，37 ℃孵育4 h；③加入DMSO 溶解所形成的紫色結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀測得每孔在490 nm處的吸光度值，分析不同處理的條件培養(yǎng)基對細(xì)胞活力和生長的影響；④連續(xù)測量5 d吸光度，進行結(jié)果分析。

1.2.6 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞懸液稀釋，每組細(xì)胞分別以1 500個/孔接種在含2 mL 37 ℃預(yù)溫培養(yǎng)液的6孔板中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37 ℃5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。然后去固定液，加適量結(jié)晶紫染液染20～30 min，然后用PBS 洗去染色液，空氣干燥。將大皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)＞10個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。

1.2.7 誘導(dǎo)成骨分化

為了進行成骨細(xì)胞分化，hBMSC在成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基（α?MEM，含5% UltraGRO、1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β?甘油磷酸酯、50 μmol/L 抗壞血酸、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素）中培養(yǎng)0～7 d。每3 d更換1次培養(yǎng)基。

1.2.8 ALP染色實驗

在成骨誘導(dǎo)第5 天進行ALP 染色。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS洗2～3次，然后與適量的BCIP/NBT 染色液混合，對hBMSC 進行染色。將hBMSC 在室溫下染色20～30 min，觀察其染色程度達到預(yù)期后，除去工作液，用ddH2O清洗2次以停止反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)皆用SPSS17.0軟件分析，每個涉及細(xì)胞的實驗都至少重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間差異用雙尾Student’st檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異基因（differentially expressed gene，DEG）和富集分析

本研究中，從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE35956）下載表達矩陣。利用其原發(fā)性O(shè)P的基因芯片，整理得到5例正常人及5 例原發(fā)性O(shè)P 患者，且年齡較為相近。隨后對芯片數(shù)據(jù)進行處理，使用DEseq2且根據(jù)|log2Fold Change|＞1，P＜0.05的條件下，篩選出1 440個DEG，其中1 161 個上調(diào)DEG，279 個下調(diào)DEG（圖1A）。

根據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto Ency?clopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫和基因本體論（gene ontology，GO）分析的結(jié)果，本研究以P調(diào)整＜0.05 為篩選條件，并按照富集于此通路的DEG 計數(shù)值從大到小排列。KEGG 結(jié)果顯示，這些DEG主要富集于神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、PI3K?Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及cAMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等（圖1B）。而在GO 分析的生物學(xué)過程（biological progress，BP）中，這些DEG主要參與單核細(xì)胞分化、淋巴細(xì)胞分化、Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞對Ⅰ型干擾素的響應(yīng)、對Ⅰ型干擾素的響應(yīng)和對病毒基因組復(fù)制的負(fù)向調(diào)節(jié)；從分子功能上看，這些DEG主要涉及受體配體活性、信號受體激活劑的活性、通道活性、被動跨膜轉(zhuǎn)運器活性、離子通道活性、門控通道活性及細(xì)胞因子活性等（圖1C）。

圖1 使用生物信息學(xué)方法對GSE35956進行分析Figure 1 GSE35956 dataset was analyzed by using bioinformatics methods

2.2 lncRNA重注釋后篩選DEG

從GEO數(shù)據(jù)庫中找到GSE35956基因芯片表達矩陣，為了研究OP中差異表達的lncRNA。根據(jù)以前的論文，在GPL570 平臺芯片上進行了lncRNA 的重新注釋［9］，注釋后發(fā)現(xiàn)了1 228個lncRNA。隨即使用DEseq2對lncRNA進行差異基因分析，根據(jù)|log2Fold Change|＞1，P調(diào)整＜0.05 的條件下，篩選出105 個DEG，其中68個上調(diào)DEG，35個下調(diào)DEG（圖2）。

圖2 對GSE35956進行l(wèi)ncRNA重注釋并進行差異表達基因分析Figure 2 LncRNA re?annotation and differential expression gene analysis for GSE35956

2.3 在正常人及OP 患者的hBMSC 中驗證RAD51?AS1的表達，并沉默RAD51?AS1的表達

在lncRNA的DEG中，lncRNA RAD51?AS1未有過相關(guān)報道其與OP 的關(guān)系。收集10 例正常人及10 例OP 患者的骨髓血，并從中提取hBMSC 驗證RAD51?AS1的表達量。經(jīng)過實時定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)RAD51?AS1 在hBMSC 中表達量較高，且相較于正常人的hBMSC，lncRNA RAD51?AS1在OP患者的hBMSC顯著下調(diào)（圖3A）。

為了探究RAD51?AS1 在hBMSC 中的作用，使用Smart Silencer，其中包括3條小干擾和3條反義寡核苷酸，防止對RAD51?AS1 的脫靶效應(yīng)。通過轉(zhuǎn)染，在hBMSC 中下調(diào)RAD51?AS1 的水平，以轉(zhuǎn)染打亂序列的小干擾作為對照。同時實時定量PCR 檢測干擾效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干擾RAD51?AS1表達的hBMSC，RAD51?AS1 的表達水平顯著下調(diào)（圖3B），證實其對RAD51?AS1干擾效果顯著。

圖3 RAD51?AS1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達及差異Figure 3 The expression and differences of RAD51?AS1 in hBMSC

2.4 沉默RAD51?AS1對hBMSC增殖的影響

為了檢測RAD51?AS1 對hBMSC 增殖的影響，沉默RAD51?AS1 表達后進行了MTT 及克隆形成實驗研究hBMSC 的增殖活力。MTT 結(jié)果顯示，沉默RAD51?AS1 后，相較于轉(zhuǎn)染對照組，細(xì)胞的增殖活力明顯降低（圖4A）。通過計算細(xì)胞克隆形成，發(fā)現(xiàn)沉默RAD51?AS1 后，hBMSC 的克隆形成能力減弱（圖4B）。

圖4 沉默RAD51?AS1影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力Figure 4 Silencing of RAD51?AS1 affects the proliferative ability of hBMSC

2.5 沉默RAD51?AS1對hBMSC成骨分化的影響

為了探究RAD51?AS1 在hBMSC 中對成骨分化的影響，在體外使用成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)hBMSC 成骨分化。在第5天的時候?qū)ζ溥M行ALP染色。根據(jù)圖所示，可以看出沉默RAD51?AS1 后，ALP 的活性顯著降低（圖5）。

圖5 ALP染色檢測沉默RAD51?AS1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響Figure 5 ALP staining detects the effect of silencing RAD51?AS1 on osteogenic differentiation of hBMSC

3 討論

本研究通過從GEO 數(shù)據(jù)庫中的基因芯片GSE35956 進行l(wèi)ncRNA 重注釋和生物信息學(xué)分析，得到了mRNA和lncRNA的差異表達基因，并利用富集分析對mRNA DEG 進行了GO 分析和KEGG 分析，挖掘其具體的生物過程、分子功能和信號通路，發(fā)現(xiàn)PI3K?Akt及cAMP信號通路在骨質(zhì)疏松中的發(fā)揮中重要作用。通過對差異表達的lncRNA 進行篩選，發(fā)現(xiàn)lncRNA RAD51?AS1 在骨質(zhì)疏松患者中顯著下調(diào)，并使用體外實驗，發(fā)現(xiàn)RAD51?AS1對hBM?SC的增殖及成骨分化的能力。

通過富集分析結(jié)合可以看出，PI3K?Akt 信號通路及cAMP 信號通路在OP 的發(fā)展中起到重要作用。既往研究顯示，PI3K/Akt/mTOR 在控制細(xì)胞生長、增殖、生存、代謝、血管生成、轉(zhuǎn)錄和翻譯方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。mTOR抑制劑被證明可以積極調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成，增加腫瘤小鼠的骨量［10］。同時，PI3K/Akt 信號通路促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，增強hBMSC 在骨再生中的治療作用［11-12］。不僅如此，PI3K/Akt/mTOR信號通路還與經(jīng)典Wnt/β?catenin 信號通路和RANK/RANKL 信號通路等多種分子信號通路相互作用，從而參與維持骨穩(wěn)態(tài)。cAMP信號通路主要通過調(diào)節(jié)鹽誘導(dǎo)激酶（salt?inducible kinase，SIK）發(fā)揮調(diào)節(jié)骨代謝的作用。研究提出，通過cAMP 調(diào)節(jié)抑制SIK是PTH1R 在骨骼發(fā)育和重塑中作用的核心，導(dǎo)致在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中，骨量顯著增加［13］。以上研究證明，PI3K?Akt 及cAMP 信號通路在促進成骨和抑制破骨的過程中發(fā)揮積極作用，能夠有效改善OP的進程。所以，未來可以針對PI3K?Akt 及cAMP 信號通路進行深入研究，繼續(xù)探討其在OP 的診斷及治療價值，對于未來進一步研發(fā)新的抗OP藥物尤為重要。

HBMSC作為成骨細(xì)胞的來源，其增殖和成骨活性活性的降低或抑制是誘導(dǎo)OP 癥患者骨丟失的主要因素［14-15］。lncRNA 可以通過調(diào)節(jié)hBMSC 的各方面功能，從而影響OP 的進程［16］。同時，lncRNA RAD51?AS1 目前已經(jīng)被證實參與多種腫瘤疾病的發(fā)展，如上皮性卵巢癌和結(jié)直腸癌等［17-18］。不僅如此，RAD51?AS1 可以通過影響RAD51 的活性，影響同源重組（HR）和DNA 雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和腫瘤發(fā)展［19］。然而，RAD51?AS1是否能夠通過調(diào)節(jié)hBMSC 的增殖和分化改善OP，對此尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RAD51?AS1在OP 患者中顯著下調(diào)。同時，通過MTT 和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，在沉默RAD51?AS1 后hBMSC 的增殖能力顯著下降。在對hBMSC 進行體外誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)沉默RAD51?AS1 后hBMSC 的ALP 活性顯著下降。但是未來仍需要構(gòu)建干擾或過表達RAD51?AS1 的慢病毒載體，通過長期穩(wěn)定影響RAD51?AS1 的表達后，完善茜素紅實驗及體內(nèi)異位成骨實驗，更好地闡明RAD51?AS1 對成骨分化的影響。

綜上，本研究首次證實RAD51?AS1 在OP 患者的hBMSC 中顯著下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)了RAD51?AS1 在hBMSC 中促進增殖及成骨分化的能力。未來仍需要對RAD51?AS1 影響成骨和成脂分化的平衡進行深入研究，探討并發(fā)現(xiàn)RAD51?AS1 在改善OP 中的具體作用機制。同時，仍需要繼續(xù)收集并擴大臨床樣本量，進一步驗證RAD51?AS1 作為OP 的在診斷中所發(fā)揮的重要作用，為治療OP 提供更好的理論基礎(chǔ)和實驗支持。