食品中黃曲霉毒素B1 的熒光免疫分析技術(shù)檢測分析

宋 姣

（新正檢驗(yàn)檢測有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是很多食品中的常見代謝產(chǎn)物，其致癌性和致畸性影響極為突出，因此國家有關(guān)部門對食品中的AFB1檢測限量有著非常嚴(yán)格的要求。由此，針對AFB1的檢測技術(shù)研究也在不斷進(jìn)行。目前，傳統(tǒng)的液相色譜法、薄層色譜法和氣相色譜法等技術(shù)已然難以滿足實(shí)際需要，由此，熒光免疫分析技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，但這種技術(shù)尚處于初始發(fā)展階段，其技術(shù)細(xì)節(jié)等還有待于進(jìn)一步探究。

在本次食品AFB1熒光免疫分析工作中，主要應(yīng)用免疫磁分離熒光檢測法，對花生中的AFB1進(jìn)行檢測，這項技術(shù)主要使用磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）進(jìn)行[1-2]。MNPs 材料具有更高的比表面積和更優(yōu)的生物相容性，其在免疫化學(xué)反應(yīng)完成后，會向反應(yīng)體系中提供一個磁場，不同反應(yīng)物因其電磁性質(zhì)的差異，會在電磁力的作用下向著不同方向做定向運(yùn)動，由此便實(shí)現(xiàn)了各種反應(yīng)物的有效分離。在此過程中，食品樣品內(nèi)含有的AFB1會大量被抗體所捕獲，而后使用近紫外波段光線對其進(jìn)行照射，即可得到具有強(qiáng)熒光的衍生物，以此來實(shí)現(xiàn)對AFB1的精準(zhǔn)分析[3-4]。目前，對于免疫磁分離熒光檢測法的研究已經(jīng)相對較多[5]。XIE 等[6]引入了“傳感探針”技術(shù)，在MNPs 材料的基礎(chǔ)上，以多孔C3N4 納米薄片材料作為探針，再輔以離子遷移譜（Ion Mobility Spectroscopy，IMS）技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對AFB1的檢測，其檢測效果較好，但其時間成本和資金成本偏高。為了克服高成本的缺陷，BECHEVA 等[7]研究人員在此基礎(chǔ)上做進(jìn)一步研究，將納米薄片替換為牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）來進(jìn)行檢測，這種檢測方法在時間和資金成本上大為降低，同時仍保持了較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1、AFB1-BSA 偶聯(lián)物、熒光素5(6)-異硫氰酸酯、二甲基甲酰胺、G25 培養(yǎng)基、2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇、AFB1抗體、牛血清白蛋白以及吐溫80 等。同時本次研究使用花生材料為基礎(chǔ)材料。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-2 型熒光免疫層析定量檢測儀、AFB1 熒光免疫層析定量檢測卡、電子天平、旋渦混勻器、離心機(jī)、超純水制備器和移液器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備黃曲霉素-牛血清白蛋白-異硫氰酸酯熒光素偶聯(lián)物

為制備此種偶聯(lián)物，將一定量的AFB1-BSA 加入pH 值為9.6 的碳酸鹽緩沖液中，再將適量的FITC溶于二甲基甲酰胺中待用。而后將二者混合于棕色試劑瓶中，于4 ℃下反應(yīng)24 h，并使用G25 中性柱對其進(jìn)行過濾，過濾完成后使用Tris 進(jìn)行洗脫處理，得到AFB1-BSA-FITC 偶聯(lián)物。

1.3.2 納米磁性顆粒與抗體的固定化

在本實(shí)驗(yàn)中，MNPs 按照Gabrovska 研究團(tuán)隊[8]的制備方法進(jìn)行制備，并使用氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行表面改性處理，確保MNPs 表面上的氨基與抗體中的氨基通過偶聯(lián)作用相連接。而后基于以下幾個步驟進(jìn)行固定化處理：①在MNPs 修飾完成后，再使用戊二醛的磷酸鹽緩沖液溶液對其進(jìn)行活化，活化完成后，使用pH 值為7.2 的磷酸緩沖液（Phosphate Buffer，PB）進(jìn)行洗滌；②將適量的AFB1抗體加入納米粒子當(dāng)中，將混合體系于4 ℃下反應(yīng)24 h，再使用PB 進(jìn)行3 次洗滌操作，并加入含有少量BSA和吐溫80 的PB 溶液在搖床上反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后，再使用PB 溶液對反應(yīng)體系洗滌4 次；③將已基本固定化的MNPs 和AFB1抗體重新懸浮于PB 溶液中，調(diào)整固定化產(chǎn)物的終濃度至5 mg/mL。

在固定化步驟完成后，還需要對固定化后的AFB1抗體的活性進(jìn)行檢測。在該環(huán)節(jié)中，使用聚苯乙烯微效板，將固定化后的AFB1抗體放置其上，對其進(jìn)行非特異性吸附。具體的抗體吸附量則通過Bradford 法（100 μg）進(jìn)行測定，AFB1抗體的數(shù)量則與MNPs 的數(shù)量等同。在以上條件準(zhǔn)備就緒后，設(shè)定AFB1-BSA-FITC 熒光共軛物質(zhì)的濃度梯度分別為30 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，以此來進(jìn)行固定化后的AFB1的抗體活性之測定。

1.3.3 樣品前處理

選取適量的花生材料，對其進(jìn)行充分研磨、過篩，得到花生粉。而后準(zhǔn)備4 個容器，其中3 個容器為實(shí)驗(yàn)組，放置等量的花生粉樣品，另一個容器為對照組，放置甲醇溶液。在實(shí)驗(yàn)組中，分別加入溶于甲醇的AFB1，使之分別達(dá)到0.4 ng/g、1.0 ng/g、2.0 ng/g 的濃度水平?；ㄉ鷺悠肪谑覝貤l件下干燥過夜，并使用濃度為80%的甲醇溶液進(jìn)行提取。①制備適量的MNP-Ab，并等分為4 份，分別放置于4個瓶子中待用；②加入適量的花生AFB1稀釋提取物，混合為懸濁液后，再將該懸濁液在37 ℃條件下于搖床中反應(yīng)15 min；③在反應(yīng)后的混合物中加入適量的AFB1-BSA-FITC 偶聯(lián)物，仍在37 ℃條件下于搖床中反應(yīng)15 min，而后對上清液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。

1.4 對MNPs 用量與熒光共軛濃度進(jìn)行優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)MNPs 用量與熒光共軛濃度的優(yōu)化，在本次實(shí)驗(yàn)中，設(shè)定3個不同的MNPs用量，為0.125 mg、0.250 mg、0.375 mg，并使用PB 的甲醇溶液進(jìn)行稀釋。具體的分析步驟如下：①將濃度分別為0.25 pg/mL、1.00 pg/mL、12.50 pg/mL、50.00 pg/mL和100.00 pg/mL的AFB1樣品等量加入到含有MNPs 的容器中，在37 ℃條件下于搖床中反應(yīng)15 min；②每個樣品中均加入等量的AFB1-BSA-FITC 熒光偶聯(lián)物，繼續(xù)在37 ℃條件下于搖床中反應(yīng)15 min；③使用磁力分離器對AFB1的MNPs 和AFB1-BSA-FITC 分別進(jìn)行收集，測定上層清液中過量的AFB1-BSA-FITC 熒光強(qiáng)度，此數(shù)值即可用來描述AFB1與MNPs 的結(jié)合情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 MNPs 的最佳用量

對于給定濃度的目標(biāo)抗原（即AFB1），均有一個最合理的MNPs 濃度與之對應(yīng)，當(dāng)AFB1濃度不同時，3 種不同數(shù)量的MNPs 中所獲得的歸一化信號如表1 所示。

表1 不同濃度梯度的AFB1 的歸一化信號情況

從表1 中的數(shù)據(jù)可以得知，MNPs 的最佳用量為0.250 mg，在這種前置條件下，上清液中過量的AFB1-BSA-FITC 熒光強(qiáng)度維持在相對偏高的狀態(tài)，在AFB1的不同濃度梯度下，熒光強(qiáng)度值的變化梯度也最為明顯。因此MNP 設(shè)置為0.250 mg 時，本次熒光免疫分析技術(shù)有著最為準(zhǔn)確的分析效果。

2.2 熒光共軛物最佳濃度的確定

為確保在不同抗原濃度下的熒光信號均能準(zhǔn)確分辨，因此對不同AFB1濃度和不同AFB1-BSAFITC 共軛濃度下的熒光歸一化信號進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AFB1-BSA-FITC的共軛濃度為28 μg/mL時，熒光信號的強(qiáng)度和分辨率均可最大限度上滿足要求，信號歸一化后可得到證實(shí)。因此，此共軛濃度為最佳的AFB1-BSA-FITC 共軛濃度，能夠確保本次建立的熒光免疫分析技術(shù)的分辨率和準(zhǔn)確性。

2.3 花生樣品中AFB1 的測定情況

在前文的3 個實(shí)驗(yàn)組中，均對其進(jìn)行提取程序，并在提取程序完成后對提取液進(jìn)行稀釋，以此來計算RSD 和回收率，計算結(jié)果如表2 所示。

從表2 中的數(shù)據(jù)可以看出，花生樣品中的回收率相對較高。同時，在不提取情況下，檢測工作均可在35 min 內(nèi)完成，同時獲得的LOD 指標(biāo)參數(shù)為0.9 mg/mL，已經(jīng)處于足夠低的水平，由此可知，本次所建立的食品中AFB1的熒光免疫分析技術(shù)能夠用于實(shí)際樣品中AFB1的檢測，同時這種方法在沒有非特異性干擾的前提下，能夠?qū)^低濃度的毒素進(jìn)行較為準(zhǔn)確的測定，檢測的線性范圍在0.25 ～100 pg/mL。

表2 各組花生樣品中的AFB1 檢測結(jié)果及回收率（n=3）

3 結(jié)論

本次研究工作中，以檢測花生樣品中的AFB1為實(shí)際案例，建立了一種靈敏度和檢測效率均較高的基于MNPs 的熒光免疫分析技術(shù)方法，該方法具有較寬的檢測線性范圍和較低的LOD 免疫檢測值，且獲得的免疫測定時間也位于35 min 以下。顯然，這種熒光免疫分析技術(shù)方法相較于傳統(tǒng)方法而言，在檢測的時間成本上優(yōu)勢較為突出，預(yù)計其在今后的食品AFB1含量檢測中有著潛在的應(yīng)用價值，有必要進(jìn)一步深入探究和優(yōu)化。