一種7β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)研究及在熊去氧膽酸生物合成中的應(yīng)用

劉英梅，郭新艷，張秀華，王麗麗，劉 飛，張曉元，陳 勉，張艷艷，袁丹丹

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類(lèi)藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類(lèi)藥物發(fā)酵與精制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

熊去氧膽酸（UDCA），化學(xué)名稱(chēng)3α, 7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，是名貴中藥材熊膽粉的主要活性成分之一，臨床用于治療膽結(jié)石和原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）等肝臟類(lèi)疾病。UDCA可提高膽汁中膽固醇的溶解度，降低膽固醇的析出，從而減少膽結(jié)石的形成，具有保肝利膽的功效。同時(shí)UDCA也是第一個(gè)經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療PBC的一線(xiàn)藥物，在食品和藥品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[1-6]。UDCA在自然界的獲得途徑主要是活熊取膽或引流取膽汁。2017年新修訂《野生動(dòng)物保護(hù)法》后，國(guó)家加強(qiáng)了對(duì)野生動(dòng)物藥物資源的管理，使得熊膽粉的資源愈加緊缺，亟需開(kāi)發(fā)人工合成UDCA[7-8]。

UDCA的合成方法主要有化學(xué)合成和生物合成兩種方法?；瘜W(xué)合成法通常是以牛、羊、豬膽酸及鵝去氧膽酸等為原料經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)合成，反應(yīng)條件劇烈，成本高，安全性能差，且可能有有毒化學(xué)試劑殘留。隨著分子生物學(xué)及酶工程的快速發(fā)展，運(yùn)用生物合成轉(zhuǎn)化得到UDCA成為一種既經(jīng)濟(jì)又綠色的手段[7]。7β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶（7β-HSDH）是UDCA酶法生物合成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶[9-11]，可用于化學(xué)藥物中間體7-羰基石膽酸（7K-LCA）向UDCA的轉(zhuǎn)化，見(jiàn)圖1。本研究通過(guò)對(duì)基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵、表達(dá)、分離、純化，得到高純度、高活性的7β-HSDH蛋白，深入研究其酶學(xué)性質(zhì)，確定酶促反應(yīng)的最適條件，為UDCA的工業(yè)化生產(chǎn)提供支持。

圖1 UDCA的酶轉(zhuǎn)化途徑

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sorvall lynx 6000臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific）；U-T6分光光度計(jì)（屹譜儀器制造）；BASIC 1645050電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）；S210K pH計(jì)[梅特勒托利多儀器（上海）]；AKTA蛋白純化層析系統(tǒng)（美國(guó)GE）。

1.2 試劑

蛋白預(yù)分子量標(biāo)記（美國(guó)Thermo Scientific）；7K-LCA（浙江華納）；還原輔酶II四鈉鹽（NADPH，上海源葉）；葡萄糖脫氫酶（GDH，上海源葉）；鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA，常州天地人和）；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，索萊寶）；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Solarbio）；薄層層析硅膠板（德國(guó)Merck）。

1.3 質(zhì)粒

7β-HSDH基因序列來(lái)源于Collinsella aerofaciens，由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司優(yōu)化并合成得到pET-28a-7β-HSDH質(zhì)粒。

1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：普通LB培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油10 g/L，蛋白胨18 g/L，酵母粉20 g/L，三水合磷酸氫二鉀16.43 g/L，磷酸二氫鉀2.31 g/L，氯化鎂0.48 g/L，調(diào)pH至7.0。

2 方法

2.1 pET-28a-7β-HSDH E. coli BL21(DE3)重組菌株的構(gòu)建

利用傳統(tǒng)熱激法（42 ℃水浴90 s）將pET-28a-7β-HSDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到pET-28a-7β-HSDHE.coliBL21(DE3)重組菌株。

2.2 pET-28a-7β-HSDH E. coli BL21(DE3)重組菌株的發(fā)酵表達(dá)

將重組菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按4 %接種量接種至含250 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，37 ℃下培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，并降溫至16 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。8000 r/min離心10 min，收集菌體，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）洗滌菌體1次。用100 ml Ni柱結(jié)合緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0）重懸，超聲破碎菌體，12 000 r/min離心10 min，得到上清樣品80 ml。

2.3 7β-HSDH重組蛋白的分離、純化

重組菌株質(zhì)粒pET-28a中含組氨酸標(biāo)簽（His-Tag），可敖合鎳親和柱（Ni柱）中的鎳離子，故使用Ni柱層析純化重組蛋白。通過(guò)AKTA蛋白純化層析系統(tǒng)，先用Ni柱結(jié)合緩沖液沖洗Ni柱至UV值不再變化，上樣2.2項(xiàng)下樣品；再用Ni柱結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0）分別沖洗Ni柱，將雜蛋白和結(jié)合不牢的目的蛋白洗滌干凈；最后用洗脫緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0）沖洗Ni柱，收集目的蛋白，置入截留分子量3 kD的透析袋，于pH 7.4磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）中透析，去除殘余咪唑，每隔4～6 h更換一次透析液，共透析48 h。置入截留分子量3 kD的濃縮管，4000 r/min離心濃縮蛋白，直至將目的蛋白濃縮至11 ml，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

2.4 7β-HSDH重組蛋白的酶活測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[7]中方法操作。酶活單位定義：相應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化 1 μmol NADPH底物所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位U。酶的比活為每毫克酶蛋白含有的活性單位數(shù)，單位為U/mg。

2.4.1 蛋白含量測(cè)定 使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。先將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至終濃度為0.2 mg/ml，按0，2，4，6，8，12，16，20 μl分別加至96孔板中（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔），加1×PBS稀釋液補(bǔ)足至20 μl。再將樣品適當(dāng)稀釋?zhuān)又?6孔板中，每孔20 μl。每孔加1×G250染色液200 μl，室溫放置3～5 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)濃度。

2.4.2 NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 用去離子水配制不同梯度濃度（0.1，0.2，0.3，0.4 mmol/L）的NADPH水溶液，以去離子水為空白，在340 nm處測(cè)吸光度，以NADPH 濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D340為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程。

2.4.3 7β-HSDH重組蛋白酶活檢測(cè) 向2 ml的比色皿中加入50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）1.935 ml，50 mmol/L NADPH（終濃度 0.5 mmol/L）20 μl，7β-HSDH 5 μl，混勻，在340 nm處調(diào)零，加入25 mmol/L 7K-LCA（終濃度 0.5 mmol/L）40 μl，充分混合，記錄反應(yīng) 30 s 后340 nm處吸光度值的變化，根據(jù)NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算30 s NADPH的變化。根據(jù)酶活單位的定義，計(jì)算7β-HSDH重組蛋白的酶活。

2.5 7β-HSDH重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.5.1 pH對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響 分別配制不同pH梯度緩沖液：pH 5.0～8.0磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L），pH 8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L）以及pH 9.0～11.0的甘氨酸（Gly）-NaOH緩沖液（50 mmol/L），每個(gè)梯度間隔0.5 pH值[12]。 測(cè)定7β-HSDH重組蛋白在pH 5.0～11.0的緩沖液中的酶活，確定7β-HSDH的最佳pH。

2.5.2 金屬離子對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響取適量NaCl，KCl，CuCl2，MgCl2，MnSO4，分別溶于50 mmol/L Tris-Hcl緩沖液（pH 5.5），配制成0，0.5，2.5，25，50，100，250，500 mmo/L金屬離子溶液[12]。測(cè)定7β-HSDH重組蛋白在含不同濃度金屬離子緩沖液中的酶活，確定金屬離子對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響。

2.5.3 溫度對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響 在底物7K-LCA和NADPH過(guò)量的條件下，測(cè)定7β-HSDH在不同溫度下的底物轉(zhuǎn)化率。向5 ml離心管中加入 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 5.5）1.6975 ml，50 mmol/L NADPH 100 μl，7β-HSDH 2.5 μl，25 mmol/L 7K-LCA 200 μl，充分混合，分別置于22，27，32，37，42，47 ℃水浴鍋反應(yīng)5 min。加濃鹽酸100 μl，再加乙酸乙酯1 ml提取后，薄層色譜（TLC）檢測(cè)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。

2.5.4 7β-HSDH重組蛋白在不同溫度下的熱穩(wěn)定性將50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 5.5）分別置于不同溫度梯度下（17，22，27，32，37，42，47，52，57，62，67，72，77 ℃）放置30 min，測(cè)定酶在不同溫度緩沖液中的瞬時(shí)酶活；將酶加入除底物外的酶活反應(yīng)體系中，分別于不同溫度梯度下（17，22，27，32，37，42，47 ℃）放置30 min，測(cè)定殘余酶活。

2.6 UDCA的酶催化合成產(chǎn)率測(cè)定

向5 ml離心管中分別加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）2070 μl， 50 mmol/L NADPH 20 μl，20 mmol/L葡萄糖 72 μl，103.41 U/ml GDH 194 μl，14 U/mg 7β-HSDH 10 μl，25 mmol/L 7K-LCA 40 μl，充分混合，37 ℃反應(yīng)5～10 h，加濃鹽酸150 μl，再加乙酸乙酯1 ml提取后濃縮，TLC檢測(cè)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)果

3.1 pET-28a-7β-HSDH E. coli BL21(DE3)重組菌株構(gòu)建、發(fā)酵、表達(dá)及蛋白分離純化

通過(guò)對(duì)pET-28a-7β-HSDHE.coliBL21(DE3)重組菌株質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，7β-HSDH酶基因序列正確無(wú)誤。發(fā)酵菌體破碎后上清經(jīng)Ni柱親和層析分離純化圖譜見(jiàn)圖2，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，去咪唑純化后最終酶蛋白液電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖2 7β-HSDH蛋白經(jīng)Ni柱親和層析分離純化圖譜

圖3 7β-HSDH蛋白親和層析洗脫液SDS-PAGE電泳圖

圖4 7β-HSDH蛋白透析前后SDS-PAGE電泳圖

由圖2可見(jiàn)，除峰1穿透峰外，主要有2個(gè)紫外吸收峰，分別為峰2、峰3，從出峰位置和峰面積大概判斷前面的峰2可能是雜蛋白和結(jié)合不牢的目的蛋白，峰3為重組7β-HSDH目的蛋白。

對(duì)洗脫的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。條帶5為圖2中第3個(gè)峰的收集液檢測(cè)條帶，條帶中幾乎全部為目的蛋白，雜蛋白較少。經(jīng)進(jìn)一步透析濃縮后用于酶學(xué)性質(zhì)研究。

透析前后酶蛋白電泳圖見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，使用透析法去咪唑，透析前后酶蛋白幾乎無(wú)損失，且最終去咪唑后的酶蛋白樣品幾乎無(wú)雜帶。

以上結(jié)果表明，重組菌發(fā)酵后，發(fā)酵菌體破壁上清經(jīng)分離、純化，可得到高純度的酶蛋白。

3.2 7β-HSDH重組蛋白的酶活測(cè)定結(jié)果

按2.4.1項(xiàng)下方法測(cè)得酶蛋白濃度為3.5 mg/ml。按2.4.2項(xiàng)下方法得到NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性方程為：y=2.5895x-0.0519，R2=0.9984。按2.4.3項(xiàng)下方法，用7β-HSDH酶蛋白液5 μl轉(zhuǎn)化NADPH，測(cè)得30 s內(nèi)，OD340的變化值為：Δy=0.32，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，并根據(jù)酶活單位的定義可知，7β-HSDH酶蛋白樣品的酶活為49.89 U/ml，比活為14 U/mg。

3.3 7β-HSDH重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

3.3.1 pH對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響 結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，pH 5.5緩沖液體系中，酶活最高，酶的比活為53 U/mg，是p8.0條件下（14 U/mg）的3.7倍左右。

圖5 不同pH對(duì)7β-HSDH蛋白酶活的影響

3.3.2 金屬離子對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，除Cu2+外，其他幾種離子對(duì)酶活均有不同程度的促進(jìn)作用，Cu2+有顯著的抑制作用。其中Mg2+對(duì)酶活的促進(jìn)作用最為顯著，在添加100 mmol/L MgCl2的緩沖液中7β-HSDH重組蛋白酶的比活最高，為83 U/mg，與未添加金屬離子的對(duì)照53 U/mg相比，酶活提高約57 %。

圖6 不同濃度金屬離子對(duì)7β-HSDH蛋白酶活的影響

3.3.3 溫度對(duì)7β-HSDH重組蛋白酶活的影響 在底物過(guò)量的反應(yīng)體系中，加入7β-HSDH重組蛋白，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，不同溫度下反應(yīng)5 min，測(cè)定UDCA產(chǎn)物的生成量。結(jié)果見(jiàn)圖7。在32～42 ℃的條件下反應(yīng)5 min，UDCA生成量最多，該溫度范圍為7β-HSDH酶酶反應(yīng)的最適溫度范圍。

圖7 溫度對(duì)7K-LCA轉(zhuǎn)化率影響的TLC檢測(cè)結(jié)果

3.3.4 7 β-HSDH重組蛋白酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性 結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。由圖8可見(jiàn)，溫度62 ℃的緩沖液中，7β-HSDH酶的瞬時(shí)酶活最高，比活為88 U/mg，是17 ℃（25 U/mg）緩沖條件下酶活的3.5倍。此結(jié)果可為后續(xù)放大生產(chǎn)過(guò)程中縮短反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本提供有效的理論依據(jù)。

圖8 不同溫度緩沖液對(duì)7β-HSDH蛋白酶活的影響

圖9 7β-HSDH重組蛋白酶在不同溫度下放置30 min后酶活變化

由圖9可見(jiàn)，7β-HSDH酶在17～27 ℃下放置30 min，7β-HSDH的酶活幾乎無(wú)損失；37 ℃下放置30 min，7β-HSDH的酶活損失約25 %；42 ℃下放置30 min，7β-HSDH的酶活損失約75 %，47 ℃下放置30 min，酶活幾乎降為0。

3.4 UDCA的酶催化合成產(chǎn)率測(cè)定結(jié)果

產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率TLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可見(jiàn)，條帶3中反應(yīng)后產(chǎn)物幾乎全部為UDCA，底物剩余量較少。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)合成的生物酶可高效合成UDCA。

圖10 酶法合成UDCA反應(yīng)產(chǎn)物TLC檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

7β-HSDH酶作為UDCA酶法合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在UDCA生物合成中具有舉足輕重的作用。本研究深入探索其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Mg2+可作為7β-HSDH酶促反應(yīng)最佳金屬離子，與未添加金屬離子的對(duì)照組相比，酶活提高57 % 左右。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，緩沖液瞬時(shí)高溫條件下，7β-HSDH酶的瞬時(shí)酶活可提高3.5倍，酶促反應(yīng)效果明顯，此結(jié)果可為后續(xù)UDCA的生物合成和工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中縮短反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本提供有效的理論依據(jù)，也可為其他化學(xué)藥物的酶法生物合成提供參考。