尼莫地平注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的探討

劉艷平，張秀花

（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274032）

尼莫地平注射液為鈣離子拮抗劑，具有抗缺血和抗血管收縮作用[1]，2005年首次載入《中國藥典》，現(xiàn)行質(zhì)量標準檢查項下仍保留熱原檢查項目[2]。尼莫地平注射液進行熱原試驗時，經(jīng)常引起試驗兔體溫異常下降現(xiàn)象，必須反復重試，消耗大量人力、物力[3]，且易導致試驗結(jié)果假陰性，臨床用藥存在較大的安全隱患。近年，關于尼莫地平注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究甚少。凝膠法為細菌內(nèi)毒素檢查的經(jīng)典方法，操作簡單，靈敏度高，干擾因素少，結(jié)果重現(xiàn)性好，替代熱原檢查法成為必然。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；ZH-2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；可調(diào)微量移液器（規(guī)格：20～200 μl，100～1000 μl，賽默飛）。

1.2 材料

鱟試劑[TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號：1908012，靈敏度（λ）為0.125 EU/ml；批號1907081，λ為0.25 EU/ml；規(guī)格均為0.1 ml/支]；TAL（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：19090812，λ為0.125 EU/ml；批號：19061612，λ為0.25 EU/ml；規(guī)格均為0.1 ml/支）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-202088，規(guī)格：60 EU/支）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號：1912241，規(guī)格：10 ml/支）；尼莫地平注射液（批號：2012196，20041164，200616，規(guī)格：100 ml:20 mg，均由委托單位提供）。無熱原吸頭（湛江安度斯生物有限公司，批號：1912241，規(guī)格：250 μl；批號：2001063，規(guī)格：1000 μl）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL λ復核

取TAL 4批，每批18支，分別加BET水0.1 ml溶解；取CSE 1支，用1.0 ml BET水溶解后，在旋渦混合器上混勻15 min，制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個濃度的內(nèi)毒素標準溶液。取不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，分別與等體積的鱟試劑溶液混合，每一內(nèi)毒素濃度平行做4管；其余2管加入等體積的BET水作為陰性對照，依法檢查[4]，并計算TAL靈敏度測定值（λc）。結(jié)果見表1。

表1 TALλ復核試驗結(jié)果

由表1可知，λc均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）范圍內(nèi)，表明復核結(jié)果符合規(guī)定，4批鱟試劑均可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

2.2 細菌內(nèi)毒素限值（L）確定

根據(jù)公式L=K/M[4]，注射劑K=5 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，臨床用量為100 ml，qd，人均體重按60 kg計算，則L=5/(100/60)=3 EU/ml。根據(jù)注射劑安全性檢查法應用指導原則[4]，為確保臨床用藥安全，本試驗細菌內(nèi)毒素限值設定至計算值的1/3，即1 EU/ml。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）確定

目前市售TALλ一般在0.5～0.03 EU/ml之間，最大有效稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ，其中C為供試品溶液的濃度，C=1.0 ml/ml。經(jīng)計算，MVD分別為2，4，8，16，32倍。

2.4 干擾預實驗

取TAL 2批，每批34支，分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批，分別用BET水稀釋2，4，8，16，32倍，每個濃度2管，標記為供試品陰性對照（NPC）系列。取CSE 1支，用BET水1.0 ml溶解，在旋渦混合器上混勻15 min后，用上述NPC系列作稀釋劑，制備2λ供試品溶液，每個濃度2管，標記為供試品陽性對照（PPC）系列，同時設置細菌內(nèi)毒素陽性對照（PC）和BET水陰性對照（NC），每個系列各2管，依法檢查，結(jié)果見表2。

表2 尼莫地平注射液干擾預實驗結(jié)果

由表2可知，NC均為陰性，PC均為陽性，試驗有效。NPC均為陰性，8倍稀釋液對TAL均無干擾作用。

2.5 正式干擾試驗

取TAL 2批，每批66支，分別加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批，分別用BET水稀釋8倍。取CSE 1支，分別用BET水和8倍稀釋液制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的BET水系列和供試液系列，每一濃度4管；其余2管加BET水作陰性對照，依法檢查，分別計算反應終點濃度的幾何平均值Es、Et。結(jié)果見表3。

表3 尼莫地平注射液干擾試驗結(jié)果

由表3可知，Es均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）之間，且Et均在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）之間，試驗結(jié)果符合細菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定，說明供試品在該濃度下無干擾作用[5]。

2.6 細菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)干擾試驗結(jié)果，取供試品3批，用BET水稀釋8倍后，分別采用兩個廠家λ均為0.125 EU/ml的TAL依法檢查，結(jié)果見表4。

表4 尼莫地平注射液細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

由表4可知，PC均為陽性，NC均為陰性，PPC均為陽性，試驗有效。供試品管均為陰性，表明3批樣品細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定[4]。

3 討論

尼莫地平注射液為幾乎無色的澄明液體，標準規(guī)定pH值為5.5～7.5[2]。鱟試劑最適反應pH值為6.0～8.0，過酸或過堿會對試驗起干擾作用[6]。經(jīng)測定，本品pH值為6.6，不需要進行酸堿性調(diào)節(jié)，稀釋法可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和TAL的反應不存在干擾作用，可以使用較低靈敏度的TAL進行干擾試驗的預實驗，正式干擾試驗時，應盡量選擇不干擾稀釋倍數(shù)或濃度對應靈敏度的TAL進行試驗[5]。由表2可見，稀釋倍數(shù)相同的樣品，對TAL的干擾作用不同。4倍稀釋液對一批TAL有干擾作用，而對另一批TAL無干擾作用，8倍稀釋液對兩批TAL均無干擾作用。MVD為8倍時對應TAL的靈敏度為0.125 EU/ml，故本試驗選用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試TAL劑進行正式干擾試驗，結(jié)果符合要求。

熱原檢查法檢驗周期長，干擾因素多，檢驗成本高，終將被細菌內(nèi)毒素檢查法替代。細菌內(nèi)毒素檢查法是藥品檢驗中應用十分廣泛的一項檢測技術(shù)，被世界各國藥典所收載[7-8]。細菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法已應用于500多種藥品或原料藥[9]。本試驗結(jié)果表明，尼莫地平注射液用BET水稀釋8倍時，對靈敏度≥0.125 EU/ml的鱟試劑無干擾作用，采用L為1.0 EU/ml進行細菌內(nèi)毒素檢查是可行的，可用于原料及制劑的質(zhì)量控制。