FTO 基因rs9939609 多態(tài)性與青少年肥胖及血細(xì)胞分析參數(shù)的相關(guān)性

寧美微，徐奧紅，曾嶸，王博達(dá)，劉湘（.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，武漢 430000；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430000）

肥胖是影響人身心健康的重要因素，肥胖癥已成為全球公共健康問題。肥胖的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。脂肪量與肥胖相關(guān)（fat mass and obesity-associated， FTO）基 因rs9939609位點(diǎn)是全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）鑒定的第 1 個(gè)肥胖易感位點(diǎn)［1］。該基因位于16 號(hào)染色體上，其表達(dá)產(chǎn)物通過神經(jīng)調(diào)節(jié)控制能量平衡，從而影響肥胖癥的發(fā)生。rs9939609多態(tài)性位于FTO基因的第1個(gè)內(nèi)含子中，對(duì)FTO 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起決定性作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因變異不僅與脂肪組織增加及炎癥有關(guān)，而且可引起相關(guān)血細(xì)胞分析參數(shù)的改變［3］。然而，目前分析肥胖與FTO基因rs9939609 多態(tài)性對(duì)血細(xì)胞分析參數(shù)影響的文獻(xiàn)少見。因此，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證青少年人群中FTO 基因rs9939609 多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性，旨在探討肥胖和FTO 基因多態(tài)性是否對(duì)血細(xì)胞分析參數(shù)產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020 年1 月至12 月于黃家湖醫(yī)院體檢的青少年人群541例作為研究對(duì)象，其中男性206例，女性335 例，中位年齡19 歲。平均體質(zhì)指數(shù)（BMI）為 21.20±3.09。根據(jù) BMI 進(jìn)一步分為體重過輕組（BMI＜18.5）、正常組（BMI 18.5 ～23.9）、超重組（BMI 24.0 ～27.9）和肥胖組（BMI≥28）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為 16 ～26 歲健康的中國漢族青少年人群；（2）各研究對(duì)象之間無親緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）貧血或患血液病、心血管疾病、肝、腎、肺等疾病或炎癥相關(guān)疾?。唬?）服用可能影響體重藥物的患者；（3）肝、腎、甲狀腺功能異常及精神功能異常患者；（4）在過去3 個(gè)月內(nèi)減重超過2.3公斤或正在接受減肥治療的人群；（5）懷孕女性。本研究經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為［2018］IEC（010）號(hào)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 Sysmex XN-1000 全自動(dòng)血液分析儀及原裝配套溶血?jiǎng)ㄈ毡維ysmex 公司），血液DNA提取試劑盒（北京索萊寶公司），PCR 擴(kuò)增試劑、Taq DNA 聚合酶（武漢生工公司），瓊脂糖電泳試劑（北京天根公司）。Nane-400 超微量核酸分析儀（杭州奧盛儀器公司），Biometra Tone梯度基因擴(kuò)增儀（德國Biometra公司），Tanon-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能公司），WIX-ep600c電泳儀、WIX-liteDNA電泳槽（北京韋克斯公司），ABI3730xl基因測序儀（美國ABI公司）。

1.3 全血細(xì)胞檢測 收集各研究對(duì)象清晨空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，顛倒混勻后置于4 ℃保存。采用半導(dǎo)體激光的流式細(xì)胞術(shù)，使用Sysmex XN-1000全自動(dòng)血液分析儀檢測血液學(xué)分析參數(shù)，激光照射細(xì)胞所得的前向散射光、側(cè)向熒光、側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。檢測指標(biāo)包括各血細(xì)胞分析參數(shù)并計(jì)算聯(lián)合炎性指標(biāo)。其中白細(xì)胞參數(shù)：白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞（NEUT）、淋巴細(xì)胞（LYMPH）、單核細(xì)胞（MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞（EO）、嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）；紅細(xì)胞參數(shù)：紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、平均血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度－標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度－變異系數(shù)（RDW-CV）；血小板參數(shù)：血小板（PLT）、血小板壓積（PCT）。聯(lián)合炎性指標(biāo)：中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)／淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（NLR）、血小板計(jì)數(shù)×中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)／淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（SⅡ）、單核細(xì)胞×中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)／淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（SⅠRⅠ）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)／單核細(xì)胞計(jì)數(shù)s（LMR）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)／淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（MLR）、血小板計(jì)數(shù)／淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（PLR）。

1.4 DNA 提取 取上述 EDTA-K2抗凝全血 200 μL，按照血液DNA 提取試劑盒說明書抽提基因組DNA。取1 μL DNA樣本，用Nane-400超微量核酸分析儀檢測 DNA 的濃度和純度，選擇濃度大于100 ng／μL，純度約為 1.8 的 DNA 樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，樣本置于4 ℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 按照文獻(xiàn)［4］中的FTO基因rs9939609位點(diǎn)引物序列，由武漢生工公司合成。FTO基因上游引物序列：5′-TCCCACTCCATTT CTGACTGTTAC-3′，下游引物序列：5′-AATTCAAAA CTGGCTCTTGAATGA-3′，擴(kuò)增片段長度為 226 bp。PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，包括 14.3 μL 無菌水，20 mmol／L Buffer 2.0 μL，2.5 mmol／L MgCl20.8 μL，2.5 mmol／L dNTP 0.4 μL，10 μmol／L 上、下游引物各 0.4 μL，5 U／μL Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，模板DNA 1 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共31 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)15 g／L瓊脂糖凝膠電泳，取出現(xiàn)目的條帶的 PCR 產(chǎn)物，利用ABI3730xl 基因測序儀進(jìn)行基因型的判定。rs9939609位點(diǎn)存在3種基因型，即TT、TA、AA。擴(kuò)增片段長度均為226 bp。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。檢測結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)、百分率（n，%）表示，率的比較采用 χ2檢驗(yàn)。用χ2檢驗(yàn)FTO rs9939609基因型分布是否符合Hardy-Weinherg平衡。二元Logistic回歸分析用于肥胖人群基因多態(tài)性的風(fēng)險(xiǎn)分析，線性回歸用于分析FTO基因多態(tài)性對(duì)血液學(xué)分析參數(shù)的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同BMI血細(xì)胞分析參數(shù)的比較 如表1 所示，大部分血細(xì)胞參數(shù)在不同BMI分組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。白細(xì)胞參數(shù)的各分類細(xì)胞在4 個(gè)BMI分組間比較差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 分別為10.931、9.946、4.412、8.980、4.584，P 均＜0.01）；紅細(xì)胞參數(shù)中的紅細(xì)胞及其衍生指標(biāo)在不同分組間的比較差異明顯（F 分別為 24.646、19.747、20.498、5.122、3.427，P 均＜0.05）；血小板參數(shù)中 PLT 組間差異最為顯著（F ＝4.215，P＜0.01）。見表 2。

表1 不同BMI分組的一般特征比較

表2 不同BMI分組的血液學(xué)分析參數(shù)比較

2.2 各組等位基因頻率的比較 FTO 基因rs9939609的3種基因型（TT、TA、AA）頻率分別為65.43% （354／541）、29.39% （159／541）和 5.18%（28／541），符合 Hardy-Weinberg 平衡（χ2＝ 3.214，P ＝0.073）。TT、TA、AA 基因型頻率在不同 BMI 分組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝28.870，P＜0.01），其中，肥胖組AA 基因型頻率顯著高于正常組，TA和 TT 基因型頻率顯著低于正常組（χ2＝ 19.845，P ＝0.000）。不同BMI 分組間的等位基因頻率無明顯差異。見表3。

表3 不同BMI分組的基因型及等位基因頻率［n（%）］

2.3 FTO基因rs9939609 多態(tài)性的肥胖風(fēng)險(xiǎn)分析以TT基因型作為對(duì)照，用二元Logistic回歸分析得出，AA基因型攜帶者的肥胖風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者肥胖風(fēng)險(xiǎn)的 8.261 倍（χ2＝19.34，P ＝ 0.000），A等位基因的肥胖風(fēng)險(xiǎn)是T 等位基因的肥胖風(fēng)險(xiǎn)的1.721 倍（χ2＝ 7.603，P ＝0.006）。見表 4。

表4 肥胖人群FTO基因rs9939609多態(tài)性的風(fēng)險(xiǎn)分析［n（%）］

2.4 FTO 基因 rs9939609 不同基因型與 BMI 及血細(xì)胞分析參數(shù)的關(guān)系 AA基因型攜帶者的WBC、EO和PLT 數(shù)值均顯著高于TA 和TT 基因型攜帶者（F 分別為 4.088、5.087、3.047，P 均＜0.05）。見表5。AA 基因型在調(diào)整混雜因素前后均與EO 相關(guān)，F(xiàn)TO基因rs9939609位點(diǎn)AA基因型是影響EO數(shù)值的獨(dú)立指標(biāo)，調(diào)整前：OR（95%CI）＝ 0.110（0.039 ～ 0.181），t ＝ 3.065，P ＝ 0.002，調(diào)整后：OR（95%CI）＝ 0.092（0.020 ～ 0.165），t ＝ 2.507，P ＝0.013。

表5 不同基因型的血細(xì)胞分析參數(shù)比較

3 討論

目前研究已證實(shí)，F(xiàn)TO rs9939609 基因多態(tài)性與肥胖相關(guān)［5］。本研究表明在中國漢族人群中rs9939609 AA 基因型個(gè)體的體重與BMI 顯著高于其他基因型，該基因型個(gè)體發(fā)生肥胖的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型個(gè)體的8.261 倍，A 等位基因的肥胖風(fēng)險(xiǎn)是T 等位基因的 1.721 倍，再一次證實(shí) FTO 基因rs9939609多態(tài)性與肥胖密切相關(guān)。最近一項(xiàng)關(guān)于中國臺(tái)灣漢族人群GWAS研究中，通過對(duì)1 110 例肥胖患者和10 852例漢族人群對(duì)照檢測結(jié)果確定了包括rs9939609在內(nèi)的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與肥胖相關(guān)［6］。盡管rs9939609是中國人群中較為常見的SNP，但它在歐洲人群中更普遍（41%）［7］。本研究結(jié)果中對(duì)照組A等位基因的頻率僅為19.87%，與之前報(bào)道的中國漢族人群中的13.2%相近［6］。提示 FTO基因該位點(diǎn)頻率存在種族和地理差異。

與此同時(shí)，一些研究證實(shí)肥胖會(huì)影響血細(xì)胞分析參數(shù)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BMI 的增加導(dǎo)致 WBC、LYMPH、RBC 和 PLT 計(jì)數(shù)的增加［8］。另有研究表明，肥胖與 WBC、PLT、PCT、NLR、SⅡ和 PLR 水平呈正相關(guān)［9-10］。與這些研究結(jié)果相似，本研究中，肥胖組的WBC 等白細(xì)胞參數(shù)水平明顯高于超重組、正常組和過輕組，其中的 RBC、Hb、HCT、PLT 和PCT水平也隨著BMI 增大而升高，而RDW-SD 水平隨著BMI增大而降低，再次證實(shí)了肥胖對(duì)各項(xiàng)血細(xì)胞參數(shù)的影響。但筆者并未發(fā)現(xiàn)NLR、PLR等炎癥標(biāo)志物與肥胖之間存在顯著相關(guān)性，這可能是因?yàn)榉逝纸M中 NEUT，LYMPH，MONO 和 PLT 水平均顯著增加。

為此，本研究進(jìn)一步探討了FTO 基因多態(tài)性是否對(duì)血細(xì)胞分析參數(shù)產(chǎn)生影響。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 基因 rs9939609 多態(tài)性與 EO 水平之間存在正相關(guān)，獨(dú)立于性別年齡和BMI 等因素，表明FTO基因的變異可能使得EO 在人體內(nèi)發(fā)生數(shù)量的變化，這與Fisher等［3］報(bào)道一致，說明 FTO 變異不僅增加脂肪組織，而且還可能增強(qiáng)脂肪組織的炎癥狀態(tài)，且與肥胖程度無關(guān)。然而Alipour 等［11］的研究結(jié)果表明，在2 型糖尿病患者中，F(xiàn)TO 基因rs9939609多態(tài)性導(dǎo)致的炎癥依賴于肥胖。有新的證據(jù)也表明，F(xiàn)TO基因通過改變下丘腦核因子kappa B 信號(hào)通路影響代謝結(jié)果，而不受體重的影響［12］。上 述不 一 致的 結(jié) 論，表 明 FTO 基 因rs9939609多態(tài)性導(dǎo)致的炎癥可能依賴于肥胖，或通過BMI調(diào)控影響FTO基因多態(tài)性對(duì)白細(xì)胞參數(shù)的作用，但該結(jié)論還需更多的機(jī)制研究闡明。

對(duì)于紅細(xì)胞參數(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)AA 基因攜帶者RBC和Hb水平更高，HCT和MCHC水平分別在A等位基因攜帶者中更高，但FTO 基因多態(tài)性對(duì)所有紅細(xì)胞參數(shù)的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Zou等［13］結(jié)果不同，原因可能與兩項(xiàng)研究的設(shè)計(jì)方法不同有關(guān)，本研究單純探討FTO 基因多態(tài)性對(duì)血細(xì)胞分析參數(shù)的影響，而Zou 等［13］的研究涉及運(yùn)動(dòng)聯(lián)合飲食的干預(yù)后，研究FTO基因rs9939609 多態(tài)性對(duì)紅細(xì)胞參數(shù)的影響。鑒于目前關(guān)于FTO 基因多態(tài)性與紅細(xì)胞參數(shù)的研究較少，二者關(guān)系究竟如何，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

對(duì)于血小板參數(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)AA 基因型的PLT水平明顯高于其他基因型攜帶者，表明血小板活化水平與 FTO 基因多態(tài)性密切相關(guān)。Kotani等［14］對(duì)日本人群 FTO 基因 rs1558902 多態(tài)性的研究結(jié)果顯示，攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因的個(gè)體PLT數(shù)值顯著高于其他個(gè)體，表明FTO 基因多態(tài)性可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)PLT 水平。本研究對(duì)rs9939609 這一位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)的基因多態(tài)性都與肥胖相關(guān)［15］，但各位點(diǎn)對(duì)血液學(xué)分析參數(shù)的影響是否一致，F(xiàn)TO基因激活血小板的信號(hào)通路是否通過肥胖的炎癥反應(yīng)調(diào)控尚不清楚。

綜上所述，本研究證實(shí)了中國人群中FTO 基因rs9939609多態(tài)性與肥胖密切相關(guān)，且肥胖會(huì)影響血細(xì)胞分析參數(shù)，同時(shí)新發(fā)現(xiàn) FTO 基因rs9939609多態(tài)性對(duì)相關(guān)血細(xì)胞分析參數(shù)會(huì)產(chǎn)生一定影響，有助于臨床對(duì)肥胖的診療及對(duì)血細(xì)胞參數(shù)影響因素的正確分析。但是，由于肥胖相關(guān)炎癥反應(yīng)是通過一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)和基因水平的特異性功能，參與調(diào)控脂肪組織炎癥的眾多炎癥細(xì)胞在肥胖的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制還不清楚，因此，需要進(jìn)一步對(duì)FTO 基因生物功能開展深入研究，以闡明FTO 基因?qū)Ψ逝趾脱?xì)胞分析參數(shù)影響的分子機(jī)制，為肥胖及其相關(guān)疾病的診療提供新靶點(diǎn)。