外泌體在肝臟疾病進展及診療中作用研究進展*

楊蘇麗，張轉(zhuǎn)，馬宇佳，徐楊，嚴永敏，王亞南（.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江 03；.蘇州市立醫(yī)院 ＆南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 500）

外泌體是細胞分泌到細胞外直徑為40～100 nm呈雙凹圓盤狀囊泡。在雙層膜的包裹下，其內(nèi)部含有DNA、mRNA、microRNA、胞質(zhì)蛋白等多種物質(zhì)［1］。外泌體可以通過其攜帶的生物分子介導細胞與細胞之間的通訊［2］。外泌體在細胞間傳送信號的方式主要有3種：（1）直接與受體細胞膜融合，釋放它們攜帶到受體細胞胞質(zhì)的“貨物”［3］；（2）通過與靶細胞膜表面的受體結(jié)合，起到信號傳導作用［4］；（3）內(nèi)吞進入受體細胞后，釋放“貨物”進入胞質(zhì)［5］。外泌體參與多個生物學過程如抗原提呈、免疫應答、細胞分化、細胞遷移和腫瘤侵襲等，其在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要的生物學作用。Povero等［6］發(fā)現(xiàn)肝細胞分泌的外泌體數(shù)量和內(nèi)容物在不同的損傷條件下發(fā)生著顯著變化，為肝病的診治提供了實驗依據(jù)。本文簡要概述了肝細胞外泌體在肝臟疾病中的作用及其臨床應用。

1 外泌體在肝臟疾病中的作用及應用

1.1 外泌體與酒精性脂肪肝 當男性每周飲酒超過14 杯或女性每周飲酒超過7 杯［7］，并導致肝內(nèi)脂肪占肝臟總重量超過5%時，即可診斷為酒精性脂肪肝?。?］。酒精可以促進外泌體的分泌，如在過量飲酒條件下，含有miRNA-122的肝細胞外泌體的數(shù)量增加。miRNA-122 通過靶向HO-1 修飾單核細胞的功能，增強單核細胞誘導的炎癥反應［9］。過量飲酒也會影響TOLL樣受體4（TLR4）通路，誘導肝臟細胞中的miR-155表達量增加。miR-155 進一步作用于過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），誘導彌漫性肺泡出血，miR-155還可以通過C／EBPβ調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，促進骨髓源性M1表型的巨噬細胞形成［10］。熱休克蛋白（Hsp）在巨噬細胞的激活中也發(fā)揮了一定的作用：熱休克蛋白是肽折疊和轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白，其還有防止細胞應激條件下蛋白質(zhì)聚集的功能。肝臟細胞通過外泌體分泌Hsp40、Hsp70和Hsp90，在應激反應中介導細胞和組織之間的通信。Hsp70具有刺激單核細胞產(chǎn)生細胞因子的免疫功能。Hsp90 則可以激活 IκB激酶和TLR4通路，從而使核因子κB（NF-κB）激活，進一步導致脂肪變性和TNFα 分泌增加，誘發(fā)炎癥反應［11］。此外，Ma 等［12］還發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白 1 和 2（MT1／2）可以激活肝臟中激蛋白激酶凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）和p38絲裂原活化蛋白激酶（P38）。在酒精誘導下，肝細胞會分泌大量富含線粒體DNA的外泌體，該外泌體通過其內(nèi)部的ASK1／P38，加重炎癥和肝損傷，促進酒精性脂肪肝炎的發(fā)生。另有研究表明，酒精會促進肝細胞外泌體的釋放，富含DAMP 的外泌體會進一步通過 Toll 樣受體9（TLR-9）激活肝巨噬細胞（HMS），加重肝損傷。同時HMS 還會上調(diào)IL-1β和IL-17，促進肝星狀細胞激活，誘導肝纖維化的發(fā)生［13］。

外泌體促進著酒精性脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展，因此阻斷外泌體的釋放可用于治療酒精性脂肪肝疾病。Verma等［14］發(fā)現(xiàn)，半胱天冬酶-3（caspase-3）和 Rho 激酶（ROCK1）可以促進外泌體的釋放。通過基因或藥理學途徑阻止caspase 和Rho激酶的激活可以減少外泌體的產(chǎn)生、酒精誘導的脂肪變性和體內(nèi)炎癥，從而阻止酒精性脂肪肝的形成。因此，阻斷caspase-3和ROCK1 可作為酒精性脂肪肝診療的新思路。此外，Saha等［15-16］發(fā)現(xiàn)酒精使外泌體分泌增加，而外泌體中的 miR-27a 可以使原始單核細胞極化為 M2 巨噬細胞［16-17］，因此，miR-27a也是一個治療酒精性脂肪肝的潛在作用靶點。

1.2 外泌體與非酒精性脂肪肝（NAFLD） 非NAFLD 是一種常見的慢性肝病。在NAFLD 發(fā)展過程中，受損或應激的肝細胞會釋放外泌體，其數(shù)量與肝細胞損傷程度密切相關(guān)［7］。研究表明，TRAIL死亡受體5（DR5）促凋亡信號介導脂毒誘導的外泌體的釋放，DR5 誘導ROCK1 激活后，促炎肝細胞外泌體被大量釋放。外泌體的釋放還依賴于腫瘤壞死因子樣凋亡誘導配體－受體2（TRAIL-r2）級聯(lián)信號。肝細胞源性外泌體中含有TRAIL，通過與TRAIL-r2相互作用，進一步激活受體相互作用蛋白激酶（RIP1），最終導致促炎巨噬細胞信號通路的激活［17］。此外，棕櫚酸鹽也可以誘導外泌體的釋放。在棕櫚酸鹽作用下，肌醇依賴酶1-α（IRE1-α）激活，然后通過X-盒結(jié)合蛋白1（XBP1）信號通路，增加外泌體釋放。釋放的外泌體可以通過C16：0神經(jīng)酰胺和鞘氨醇磷酸一磷酸受體1（SIP1），介導巨噬細胞趨化，將巨噬細胞募集到肝臟，從而起到促進炎癥的作用［18］。脂肪肝患者MLK3激活JNK，使CXCL10在肝細胞分泌的外泌體中富集，誘導巨噬細胞向損傷部位募集，促進炎癥發(fā)生。另外，肝細胞源性循環(huán)外泌體中，線粒體 DNA（mtDNA）含量增加。mtDNA可激活核內(nèi)體模式識別受體9（TLR9），上調(diào)IL-1受體拮抗劑（IL-1RA），從而誘發(fā)炎癥［19］。

外泌體在NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，并為診斷和治療NAFLD提供了新思路。如高飽和脂肪、高果糖和高膽固醇飲食小鼠，分離的血清外泌體中細胞色素p4502E1（CYP2E1）水平升高。ROCK1 抑制劑法舒地爾（fasudil）可有效地阻斷脂毒誘導的外泌體釋放，降低外泌體中CYP2E1濃度及FFC飲食誘導的肝臟IL-1β mRNA 水平；法舒地爾還可以顯著減輕纖維化，阻止NAFLD的形成［18］。因此，法舒地爾可用于NAFLD 未來藥物的開發(fā)。外泌體釋放后會進一步通過血管非炎性蛋白1（VNN-1）誘導血管生成，并通過內(nèi)皮細胞介導其內(nèi)化［20］。肝細胞來源的VNN-1 陽性外泌體是NAFLD治療的潛在靶點，同時也是肝臟損傷的生物學標志物，可用于NAFLD的早期診斷。Liu 等［21］還發(fā)現(xiàn)，脂毒性損傷的肝細胞釋放的外泌體中miR-192-5p 的表達量增高，且與肝巨噬細胞的激活以及肝臟炎癥損傷有著密切關(guān)系。此外，NAFLD 患者肝臟炎癥水平和miR-192-5p水平呈正比。因此，miR-192-5p也可以作為NAFLD 的分子標志物［21-22］。

1.3 外泌體與病毒性肝炎 病毒性肝炎尤其是甲、乙、丙型病毒性肝炎仍是全球重大的健康問題［22-23］。外泌體在病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，主要表現(xiàn)在2個方面：一方面外泌體能影響機體的免疫反應；另一方面，它增強了病毒的傳播。

乙型肝炎病毒是一種雙鏈DNA的肝特異性病毒。研究表明，HBV感染的肝細胞能釋放含有病毒核酸的外泌體，通過信號轉(zhuǎn)導通路，刺激巨噬細胞表達NK細胞活化性受體的配體，使得NK細胞活化，在病毒感染早期促進IFN-γ 的生成，從而誘發(fā)HBV 的進一步發(fā)展［24-25］。但亦有研究表明，慢性乙型肝炎患者的血清中存在內(nèi)含HBV 病毒的外泌體，會損傷NK細胞，從而減少IFN-γ的生成，抑制NK細胞的增殖和存活，這可能是病毒擺脫宿主固有免疫的機制［21］。此外，在HBV病毒感染的肝細胞中，HBVmiR-3的表達量隨著感染時間延長逐漸增加。HBVmiR-3 下調(diào)細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子5（SOCS5），使Janus激酶（JAK）／信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路激活，從而增強HBV病毒的效應。同時，外泌體中的HBVmiR-3 可以抑制SOCS5 介導的增強型表皮生長因子受體（EGFR）泛素化，促進IL-6 的分泌，以及誘導巨噬細胞M1 極化，從而促進炎癥進一步發(fā)展［25-26］。

丙型肝炎病毒是RNA病毒，傳播途徑為血源傳播，是引起晚期肝病的重要病因。HCV感染的肝細胞能分泌攜帶含有病毒核酸和蛋白質(zhì)的外泌體，并將其內(nèi)容物傳遞給其他肝細胞，這種傳播方式在一定程度上會抑制抗病毒抗體的作用，增強病毒的傳播［22］。Aydin 等［27］發(fā)現(xiàn)在持續(xù)感染HCV的細胞中，外泌體釋放增加。外泌體能促進HCV 的復制，且能促進干擾素λ的分泌。此外，感染HCV的肝細胞分泌的外泌體中含有Ago2蛋白、Hsp90和miRNA-122，它們能夠穩(wěn)定外泌體中的丙肝病毒核酸，從而提高HCV傳播穩(wěn)定性和感染性［23］。而HCV 感染的肝細胞分泌的外泌體中Tim-3／gal-9的表達量也會增加，它會促進CD4（＋）T細胞轉(zhuǎn)化為 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞，從而影響單核細胞的分化，繼而抑制機體的免疫反應［24］。

肝炎病毒也能感染肝臟非實質(zhì)細胞如肝竇內(nèi)皮細胞（LSECs）、庫普 ffer 細胞（KCs）、肝星狀細胞（HSCs）等。盡管肝炎病毒并未在這些細胞中復制，但會刺激細胞分泌含有抗病毒分子的外泌體，從而阻斷病毒的復制和傳播［28］。因此，分析外泌體攜帶的抗病毒分子可以為診療病毒性肝炎提供新思路。

1.4 外泌體與肝纖維化和肝硬化 肝纖維化是一個病理生理過程，在多種因素引起肝臟慢性炎癥，Ⅰ型膠原纖維等細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積在肝細胞間形成纖維性瘢痕，在肝纖維化發(fā)展的晚期階段會進一步發(fā)展為肝硬化［29］。在肝纖維化期間，受損肝細胞釋放的外泌體能夠通過多種途徑促進纖維化的發(fā)展。Charrier 等［30］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織生長因子（CTGF）在活化的肝星形細胞（HSCs）中的表達量增高。CTGF是一種在多種纖維化過程中起促進作用的多功能肝素結(jié)合糖蛋白，CTGF 經(jīng)外泌體在HSCs 間轉(zhuǎn)運并直接調(diào)節(jié)活化HSCs，促進其進行有絲分裂、趨化和纖維化等活動［31］。另外，miR-122 是肝臟特異性表達的一種miRNA，約占肝細胞表達miRNA的72%。miR-122 作為促進纖維化因子，能夠調(diào)控肝細胞的生長周期、脂質(zhì)和膽固醇代謝等重要生理功能，并通過外泌體攜帶參與HSCs 的活化［32］。絲裂原活化蛋白激酶 3（MAP3K3）是 HSCs 中與 miR-122 結(jié)合的靶點，MAP3K3與miR-122結(jié)合后會促進上皮細胞轉(zhuǎn)化成為肌成纖維樣細胞（MFC）。MFC 能分泌大量膠原，而膠原正是肝纖維化中細胞外基質(zhì)的主要物質(zhì)；同時MFC還能下調(diào)黏附分子、上調(diào)間充質(zhì)，進一步促進肝纖維化［33］。對于慢性乙型肝炎患者，低水平的血清miR-122可能意味著嚴重的重度肝臟纖維化［34］，這也提示了肝纖維化的病理改變與外周血中外泌體的釋放有關(guān)。此外，在四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化或肝硬化模型中，小鼠外周血中外泌體源性miRNAs表達量顯著增高，這些miRNAs在HSCs的活化、增殖以及遷移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用［35］。外泌體源性miRNA 可誘導和促進肝纖維化及其他伴有門脈高壓的肝臟疾病的發(fā)展［36］。

具有促增殖活性的外泌體可以逆轉(zhuǎn)各種原因引起的肝損傷，并且可以成為未來肝損傷的新型療法［37］。外泌體中miR-155與肝硬變的進程及預后有著密切關(guān)系，隨著肝纖維化和肝硬化的程度的加重，miR-155 的表達量隨之增加。因此，外泌體中的miR-155可作為肝纖維化診斷的生物學標志物［38］。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，miR-124［39］和miR199a-5p［40-41］經(jīng)外泌體在其鄰近的肝細胞或HSCs間轉(zhuǎn)運，可與CTGF2的3′－非編碼區(qū)直接結(jié)合并抑制其表達，從而阻礙肝纖維化的發(fā)展。這種肝細胞或HSCs之間外泌體的相互傳遞過程，可能受到整合素αγβ3、整合素 α5β1 及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖調(diào)節(jié)［41］。這些外泌體穿過細胞間隙，在不同肝細胞之間傳遞“治療分子”，導致膠原酶活性升高，活化的肌成纖維細胞凋亡及促炎細胞因子和促纖維化細胞因子的減少，最終導致ECM產(chǎn)生減少和肝纖維化消退［39］。Tang等［42］還設(shè)計了攜帶靶向轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的siRNA 或反義寡核苷酸的外泌體 （iExosiRNA-STAT3或iExomASO-STAT3）。iExosiRNA-STAT3或iExomASO-STAT3治療可以有效抑制小鼠肝纖維化，減輕肝損傷，為肝纖維化提供了一種新策略。

1.5 外泌體與肝細胞癌 肝細胞癌（HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌，也是癌癥相關(guān)的第二大死亡原因［43-44］。其危險因素主要有病毒性肝炎、肝硬化、長期過量飲酒、家族史、化學污染等，近年來肥胖導致的非酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎也日益成為肝細胞癌的重要病因之一［44］。外泌體在肝細胞癌的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。肝細胞癌細胞分泌的外泌體中含有多種miRNA，這些miRNA通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β激活酶-1（Tak-1）的活性，促進肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展［42］。此外，肝細胞癌是一種高度依賴血管的腫瘤，血管能為其生長活動提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)。癌細胞分泌的外泌體則可以促進血管生成，從而促進肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展［2］。肝細胞癌細胞分泌的外泌體中還含有miR-103，其可作用于內(nèi)皮細胞，增加血管的通透性，進而促進肝細胞癌的轉(zhuǎn)移［2，45］。

肝細胞癌來源的外泌體攜帶特有的標志物，可將其作為肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸治愈的分子標志物，從而監(jiān)測肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展治療的整個過程。Kogure 等［46］在Hep3B衍生的外泌體中發(fā)現(xiàn)了134個miRNAs，其中有11個miRNA（如 miR-584 和 miR-517c）為外泌體所特有，這些miRNA可作為監(jiān)測的靶點。將含有特定生物分子或小分子藥物的外泌體進行改造，再將其遞送至靶細胞發(fā)揮生物效應，可起到治療的作用。如Hsp 可提高腫瘤免疫原性并誘導NKT細胞的抗腫瘤反應，故而攜帶HSP 的外泌體可成為肝細胞癌免疫治療的新策略［47］。在肝細胞癌患者中，外泌體內(nèi)miR-638表達量增高，且miR-638與腫瘤復發(fā)有關(guān)。因此，miR-638可能成為肝細胞癌的一項預后指標［48］。此外，Yu等［49］發(fā)現(xiàn)外泌體中DEAD盒解旋酶55（DDX55）介導肝癌細胞與內(nèi)皮細胞以及高、低DDX55水平的肝癌細胞之間的細胞交流，促進肝癌細胞血管的生成以及惡性表型的形成。因此，DDX55也可以作為HCC 的一個治療靶點以及預后指標［49-50］。表1中為外泌體在肝臟疾病中的作用及其臨床應用概括。

表1 外泌體在肝臟疾病中的作用及其臨床應用

2 外泌體檢測技術(shù)

2.1 微流體動力捕獲裝置 該裝置結(jié)合了親和力和被動微流控粒子捕獲的方法來對外泌體進行定量檢測。首先將直徑為20 μm的微球用鏈霉親和素和生物素化抗體激活，然后用抗原－抗體親和結(jié)合的方法將外泌體固定在微球表面，最后再用具有捕獲陣列的微流體裝置捕獲單珠，隨后進行下一步分析。這種微流體裝置可以對外泌體進行快速精準定量，很好地滿足了臨床快速定量檢測外泌體的需求［50］。

2.2 CRISPR／Cas12a 系統(tǒng) 該方法基于 CD63 適配體和成簇的規(guī)則間隔短回文重復（CRISPR）／Cas12a 系統(tǒng)檢測外泌體。CD63適配子作為一種適應性強的核酸鏈，負責將大量的外泌體轉(zhuǎn)化為核酸進行檢測；CRISPR／Cas12a負責高度特異性擴增核酸信號。該方法的檢測范圍為（3×103～6×107）粒子／μL。該方法的敏感性和特異性都較高，為外泌體的臨床應用奠定了基礎(chǔ)［51］。

2.3 納米等離子體夾層免疫分析法 該方法用金－銀核殼納米金字塔和金納米棒和外泌體形成三明治免疫復合物，隨后進行免疫分析，產(chǎn)生獨特的等離子體信號，從而快速、敏感地檢測外泌體。該技術(shù)為外泌體的檢測提供了一種新穎可行的方法，可以用于癌癥的早期診斷［52］。

2.4 納米磁珠檢測法 該方法首先利用一種類似楊梅的磁珠，與適配體偶聯(lián)，對外泌體進行捕獲和回收。隨后，通過三色探針識別表皮生長因子受體（EGFR）和上皮細胞黏附分子（EpCAM），或自動錨定到脂質(zhì)雙層，對外泌體蛋白（EGFR和EpCAM）和外泌體進行定量。該方法對EGFR的檢出限為 0.96 pg／mL，EpCAM 的檢出限為 0.19 pg／mL，外泌體的檢出限為2.4×104個／μL，準確性較高。此外，該技術(shù)可用于分析血漿中的外泌體，以對癌癥進行篩查，癌癥診斷的準確率可達96.0%。該技術(shù)為外泌體分析和智能疾病診斷提供了新方法［53］。

2.5 全內(nèi)反射成像橢圓偏振法 該方法使用傳感表面來捕獲外泌體，還可以通過全內(nèi)反射成像橢圓偏振法（TIRIE）檢測外泌體表面標志物。該方法檢出限為0.4 μg／mL。該方法較之傳統(tǒng)方法更為方便、快速、準確，為外泌體的臨床檢測提供了新手段［54］。

2.6 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的信號放大系統(tǒng) 1，2-二油?；?3-三甲基銨－丙烷脂質(zhì)體表面固定的適配體可以和靶外泌體膜蛋白高特異性地結(jié)合，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的聚合反應再將適體－外泌體復合物的信號放大，從而實現(xiàn)外泌體的高靈敏度檢測。該方法與其他方法相比，可以精確識別外泌體亞群，且無需標記和分離，為精準治療提供了新策略［55］。

2.7 基于紙張的ITP 技術(shù) 該技術(shù)整合了ITP 的聚焦能力和基于紙張的橫向流的多重能力，可以精準地從外囊泡中分離得到靶外泌體并進行電動富集。該方法檢測范圍為（1.2～2.0）×106個／mL。該技術(shù)可以準確地識別靶外泌體亞群，還能多重檢測目標外泌體的蛋白質(zhì)生物標志物，為外泌體的臨床應用提供了技術(shù)支持［56］。

2.8 鐵基金屬有機框架 該方法首先利用CD63蛋白適配體作為光學活性層和外泌體特異性識別元件，接著又構(gòu)建了Fe-MOF生物界面，外泌體與CD63蛋白適配體特異性結(jié)合改變了Fe-MOF表面DNA配體的構(gòu)象，導致Fe-MOF催化活性發(fā)生變化，最終顏色發(fā)生了顯著變化。該方法檢出限為 5.2×104

個／μL。此技術(shù)使外泌體檢測可視化，并且經(jīng)濟、快速、方便，在臨床上有很大應用價值［57］。外泌體的各種檢測方法見表2。

表2 外泌體的檢測方法

3 外泌體內(nèi)容物的檢測

在雙層膜的包裹下，外泌體其內(nèi)部攜帶著蛋白質(zhì)、DNA、mRNA和miRNA等生物分子，目前的檢測技術(shù)主要針對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)3個方面來對外泌體進行分析。

3.1 蛋白質(zhì)檢測 當飲酒過量誘發(fā)酒精性脂肪肝時，患者肝細胞通過外泌體分泌Hsp40、Hsp70以及Hsp90，誘導應激反應；有研究表明肝炎病毒感染的肝細胞能分泌攜帶含有病毒蛋白質(zhì)的外泌體，如Ago2 蛋白、Hsp90 等，同時還能將這些病毒蛋白傳遞給其他肝細胞；在肝纖維化期間，結(jié)締組織生長因子在活化的肝星形細胞中表達量增高。肝細胞源性外泌體中含有TRAIL，肝臟疾病在不同階段，肝細胞來源的外泌體中所含的蛋白質(zhì)不同，均可作為檢測靶點，為診斷和治療提供了新思路。

目前比較常見的外泌體蛋白質(zhì)檢測方法有蛋白免疫印跡、ELISA、流式細胞術(shù)、質(zhì)譜法等。此外，Liu 等［58］研究出了納米酶傳感器陣列加上溶劑介導的信號放大法來分析外泌體蛋白質(zhì)。該方法利用適體修飾的C3N4 納米片（Apt／C3N4 NSs）和溶劑介導的信號放大構(gòu)建了納米酶傳感器陣列，用于外泌體蛋白的比率熒光檢測。該技術(shù)外泌體的檢出限為 2.5×103粒子／mL。此外，通過算法學習，該技術(shù)可以分析不同患者血液中外泌體蛋白的差異。Di 等［59］研發(fā)了一種納米酶輔助免疫吸附分析（NAISA）法，對外泌體蛋白進行快速的多重分析。這種NAISA系統(tǒng)是將類過氧化物酶納米酶安裝到外泌體的磷脂膜上，再使用納米酶催化的比色法對外泌體蛋白通過測定，時間少于3 h，無需多步驟溫育和洗滌操作。該技術(shù)可以分析來自不同細胞系和臨床樣本的外泌體蛋白，且檢測快速方便，在癌癥的早期診斷和鑒別方面有很大的應用價值。

3.2 核酸檢測 肝細胞可以分泌外泌體，將核酸從其親本細胞轉(zhuǎn)移到目標受體細胞。外泌體中被高度認為是肝臟疾病生物學標志物的成分之一是核糖核酸，包括信使mRNA以及microRNA等。當過度飲酒時，含有miRNA-122的肝細胞外泌體的數(shù)量增加。同時，過量飲酒激活了TOLL樣受體4（TLR4）通路，誘導肝細胞外泌體中miR-155 表達量也增加。此外，肝細胞源性循環(huán)外泌體中，mtDNA 含量增加，mtDNA會誘發(fā)炎癥，導致疾病的加重。研究發(fā)現(xiàn)，病毒性肝炎患者的肝細胞分泌的外泌體含有病毒核酸，加重了機體的感染。肝臟疾病進展到晚期有很大的可能性會發(fā)展成為肝細胞癌，肝細胞癌細胞分泌的外泌體中含有多種miRNA，如miR-103，這些miRNA可以促進肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展以及惡性轉(zhuǎn)移等?？傊?，不同肝臟疾病患者的肝細胞分泌的外泌體都攜帶特有的標志物，能夠作為肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸治愈的分子標志物。

目前比較常見的外泌體核酸檢測方法有熒光定量PCR、二代測序技術(shù)等。陳晨［60］提出了單分子定位顯微鏡（SMLM）外泌體超分辨成像技術(shù)。該技術(shù)優(yōu)化了單分子定位顯微鏡成像時間與空間分辨率，可以追蹤單個外泌體內(nèi)部miRNA在細胞內(nèi)的動態(tài)變化以及記錄外泌體在受體細胞內(nèi)釋放miRNA的全過程。此外，該技術(shù)還可以通過算法學習，對外泌體表面腫瘤標志物的表達量進行分析。Jiang等［61］研究出了原位外泌體miRNA 的測定技術(shù)。該技術(shù)首先合成 5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸，Au-DTNB），進入外泌體，與目標miRNAs 結(jié)合后誘導拉曼散射信號。接著加入Fe3O4-TiO2納米粒子，通過TiO2外殼的親和作用富集外泌體，進一步檢測拉曼散射信號。該技術(shù)miRNA 的檢出限為0.21 fmol／L。該方法不需要預處理且不需要捕獲抗體，可作為一項無創(chuàng)液體活檢技術(shù)應用于臨床診斷。Zheng等［62］設(shè)計了DNase Ⅰ輔助2′-o-甲基分子信標（eMB）來定量檢測外泌體miRNA。eMB可以抵抗DNase Ⅰ的酶消化，因此，該技術(shù)可以高度敏感地檢測miRNA（檢測限為2.5 pmol／L）。此外，Qian等［63］還設(shè)計了外泌體miRNA等溫擴增和檢測的便攜式系統(tǒng)。該系統(tǒng)由2個連接的流動池組成，分別用于處理外泌體和檢測miRNA。從外泌體中提取的miRNAs 通過芯片擴增然后進行定量檢測。此外，其還搭建了便攜式檢測儀器，使用低成本微控制器進行核酸擴增，熒光圖像，放大曲線等分析。該技術(shù)為外泌體miRNAs 的即時液體活檢提供了實驗依據(jù)。

3.3 脂質(zhì)檢測 大多數(shù)關(guān)于外泌體診斷價值的研究都集中于蛋白質(zhì)和miRNA。外泌體外層的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)使得外泌體在體內(nèi)外均能保持穩(wěn)定，外泌體中特定的脂質(zhì)組合可以很好地成為早期檢測肝臟疾病的生物學標志物。Benous等［64］利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜對外泌體的脂質(zhì)進行了分析。其使用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析了壞死的股骨頭和健康人股骨頭的外泌體脂質(zhì)代謝差異，鑒定出18種差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，為外泌體代謝分析提供了新思路。與非HCC外泌體相比，HCC外泌體中富集了10種脂類。使用超高分辨率質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)，外泌體鞘氨醇、雙心磷脂、溶血磷脂酰絲氨酸和O-?；?1-羥基脂肪酸的高豐度與HCC 密切相關(guān)［65］。目前比較常用的外泌體脂質(zhì)檢測方法有質(zhì)譜法、熒光測定法等。

4 總結(jié)和展望

外泌體是細胞分泌到外環(huán)境的納米級囊泡，所攜帶的疾病特異性蛋白質(zhì)、核酸等均可作為檢測靶點，為診斷和治療提供了新方案。但是，要將外泌體應用于臨床治療還面臨著很大的挑戰(zhàn)。首先，我們對外泌體的合成機制及具體功能了解的還不夠透徹；其次，現(xiàn)階段缺乏經(jīng)濟有效的外泌體分離技術(shù)，而無法大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；最后，目前尚不能做到抑制外泌體中某個與疾病發(fā)生相關(guān)分子活性的同時，不影響外泌體的正常功能。雖然當前外泌體生物學仍然不夠成熟，但隨著越來越多研究者的加入，相信在不久的未來，外泌體可在臨床上得以廣泛應用，為患者帶來福音。