燈籠紅香瓜枯萎病病原菌分離鑒定及藥劑防治研究

白錦江，趙 健 ，劉 穎，鄭紅麗 ，趙明敏

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011；2.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 東勝 012000）

甜瓜（Cucumis melo L.）又稱香瓜，屬葫蘆科一年生蔓性草本植物，是我國主要的瓜類經(jīng)濟作物[1]。燈籠紅香瓜是內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣最具特色的果蔬產(chǎn)品之一，因其成熟果實外形酷似燈籠，被譽為燈籠紅。目前，五原縣燈籠紅香瓜被正式納入全國名特優(yōu)新農(nóng)產(chǎn)品名錄和全國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志[2]。在溫室大棚內(nèi)種植燈籠紅香瓜，實現(xiàn)了多季節(jié)供應(yīng)，經(jīng)濟效益較高[3]。然而，溫室連作情況日益嚴重，導(dǎo)致燈籠紅香瓜病蟲害逐年加劇，產(chǎn)品產(chǎn)量及品質(zhì)降低。

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）屬半知菌亞門（Deuteromycotina）鐮刀菌屬（Fusarium），是一種土傳病害，能引起枯萎病[4]。1894年Smith在美國的南卡羅來納州發(fā)現(xiàn)甜瓜枯萎病后，該病害已蔓延至世界各甜瓜產(chǎn)區(qū)。尖孢鐮刀菌在土壤中作為厚垣孢子可以存活數(shù)十年[5]。尖孢鐮刀菌包括致病性和非致病性菌株，并根據(jù)寄主范圍分為不同的營養(yǎng)型，有些進一步細分為不同的生理小種[6]。該菌能侵染葫蘆科、芭蕉科、薔薇科、十字花科、茄科和豆科等100多種植物[7]。植株被尖孢鐮刀菌侵染后，發(fā)病癥狀多種，初期的癥狀表現(xiàn)為嫩葉上出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象，之后老葉開始下垂。苗期植株發(fā)病后迅速死亡；成株期發(fā)生葉脈失綠和葉片下垂，植株長勢暫緩，下部葉片黃化，形成不定根，葉片和嫩莖萎蔫，剩余葉片邊緣壞死，全株死亡[8]。維管束組織的褐變是尖孢鐮刀菌引起枯萎病的最鮮明特征。從盛花期到果實成熟期，在較老的植株上，癥狀會變得明顯[9]。尖孢鐮刀菌在植株根部維管束中定殖，導(dǎo)致導(dǎo)管堵塞，地上部分枯萎，根表皮產(chǎn)生褐色壞死斑，后期根部腐爛甚至整株植株死亡，嚴重影響植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)[10]。

隨著瓜類枯萎病的嚴重發(fā)生，目前已對其病原菌進行分離和鑒定。RAHMAN等[11]利用EF引物對馬來西亞豐盛港、沙登和關(guān)丹3個主要瓜類產(chǎn)區(qū)的瓜類枯萎病主要病原物進行分離鑒定，確定其病原為尖孢鐮刀菌。耿麗華等[12]利用形態(tài)學(xué)特征和rDNA ITS序列分析法，鑒定了北京通州試驗基地的甜瓜新病害是由尖孢鐮刀菌引起。該病原菌在溫濕度條件合適的情況下會迅速產(chǎn)孢并侵染作物，如不能及時進行預(yù)防與防治，會造成農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量嚴重下降。

對環(huán)境友好的植物源藥劑與綠色發(fā)展更貼切。李家洲等[13]利用中藥材植物的水提液與乙醇提液對尖孢鐮刀菌進行菌絲生長和孢子萌發(fā)的研究，結(jié)果表明，白丁香、黃連、姜黃的水提液對病原菌有良好的抑制效果。呂云霞[14]提出利用中藥防治對作物的難治病害進行防控，田間試驗結(jié)果表明，碧護、禾生素等含有植物類物質(zhì)的藥劑混合使用，對馬鈴薯、番茄、瓜類、大豆的難治病害有一定的防治效果，該防治方法還可以起到緩解藥害、肥害，促進生長等作用。ZHENG等[15]對馬鈴薯枯萎病防治的研究結(jié)果表明，植物源提取物蛇床子素對馬鈴薯枯萎病病原菌具有一定的抑制作用。

為了明確內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣燈籠紅香瓜枯萎病的病原菌，本研究對五原縣甜瓜枯萎病進行樣品采集、病原菌分離、回接試驗及病原菌分子鑒定，同時研究了不同藥劑對該病害的室內(nèi)防治作用，旨在為內(nèi)蒙古五原縣燈籠紅香瓜枯萎病的防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試病樣：2020年4月25日在巴彥淖爾市五原縣隆興昌鎮(zhèn)溫室內(nèi)采集新鮮樣本，隨機選取9株癥狀典型的燈籠紅香瓜病株。培養(yǎng)基及試劑：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）為馬鈴薯200 g﹑葡萄糖 20 g﹑瓊脂粉 20 g﹑蒸餾水 1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose，PD）：不加瓊脂粉，其他成分同PDA。燈籠紅香瓜種子采購自巴彥淖爾市臨河區(qū)種子市場。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒課題組自主研發(fā)的3種中藥復(fù)合制劑分別命名為植物免疫誘抗劑JM1、JM2、JM3，植物源藥劑蛇床子素由西安全奧生物科技有限公司提供。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)

在隨機選取發(fā)病的香瓜莖基部病健交界部位切取大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織塊，75%乙醇消毒30～40 s，然后移入5%次氯酸鈉消毒3 min，用無菌水沖洗3次，再用高溫滅菌的濾紙吸干組織塊表面的水分。消毒后的組織塊移入PDA平板，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，挑取菌落邊緣新生菌絲進行純化培養(yǎng)，5 d后挑取新生菌絲，采用梯度稀釋法進行單孢純化。將純化好的真菌分離物接種到PDA斜面試管內(nèi)，28℃培養(yǎng)3 d后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌形態(tài)觀察

將分離得到的真菌分離物接種在PDA平板上，在（28±1）℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，觀察分離物在PDA培養(yǎng)基上的特征，包括菌落的形狀、大小、顏色，分別記錄菌落的形態(tài)和顏色。在培養(yǎng)好的菌落表面用無菌接種針挑取少量菌絲，置于載玻片上，滴加無菌水，輕壓蓋玻片制成臨時玻片，然后在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲、孢子形態(tài)及菌核的有無，并用顯微鏡附帶軟件對菌絲和分生孢子進行拍照，根據(jù)分離物在PDA培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)性狀及顯微觀察的結(jié)果，對分離物進行初步鑒定。

1.4 病原菌回接試驗

燈籠紅香瓜育苗前將種子在水中浸泡1 h，再用2%的次氯酸鈉消毒10 min，之后用無菌水沖洗，最后在濕潤紗布上進行種子催芽，待種子發(fā)芽后將種子播種到已滅菌的基質(zhì)土中。待植株3～4片葉時，用分離得到的菌株進行致病性測定，采用無傷接種法對植株進行孢子懸浮液灌根接種。試驗設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種10棵植株，以不帶菌的PD液體培養(yǎng)基作為對照組。分別挑取病原物真菌菌絲放置于PD液體培養(yǎng)基中進行搖菌產(chǎn)孢，采用血球計數(shù)法計算孢子量。在每棵植株距莖基部1 cm處灌根1×107個孢子，將試驗組和對照組置于25℃溫室中保濕培養(yǎng)，連續(xù)觀察。待發(fā)病后，重新分離病原物，進行柯赫氏法則驗證。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離物的基因組 DNA。用真菌通用（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ITS4：TCCTCCGCTTAT TGATATGC）擴增病原菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），25 μL PCR 體系為：ddH2O 17.375 μL，正反向引物 （10 μmol/L） 各 1 μL，DNA 模板 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，r-Taq酶 0.125 μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 30 s；55℃退火 30 s；72℃延伸 1 min，34個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖進行凝膠電泳，在凝膠成像儀上檢測并拍照，將PCR擴增成功的產(chǎn)物送至華大基因公司測序。測序結(jié)果在NCBI上利用BLASTn進行同源序列檢索，選取相似序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件，采用ClustalW算法對序列進行比對，用比鄰法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.6 藥劑室內(nèi)防治試驗

采用盆栽法選取自制的植物免疫誘抗劑JM1、JM2、JM3原液和蛇床子素（5 mg/mL）進行防治試驗。待燈籠紅香瓜幼苗3～4片葉時，分別使用5 mL藥液在距離植株根系1 cm處灌根。每種藥劑處理接種10株香瓜幼苗。24 h后采用無傷接種法灌根接種已分離的病原菌。以健康植株為陽性對照，未做藥劑處理但接種病原菌的處理為陰性對照。觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病植株的病情指數(shù)和藥劑的防治效果。參考周婧等[16]的甜瓜苗期枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)，0級：莖基部無褐變；1級：莖基部褐變；2級：莖基部1/2處褐變；3級：莖基部2/3處以上褐變；4級：莖基部到頂端所有維管束褐變，根部壞死。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，并用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件中的Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

田間采集的燈籠紅香瓜枯萎病的癥狀表現(xiàn)為老葉萎蔫（圖1a），褪綠葉片邊緣壞死（圖1b）。葉片從基部向頂端逐漸萎蔫，葉脈失綠，植株生長緩慢、下部葉片黃化、葉片和嫩莖萎蔫、落葉，癥狀嚴重的植株葉片全部萎蔫，全株死亡。后期植株根部出現(xiàn)褐變，拔出病變植株觀察根部，莖基部有縊縮（圖1c），根部維管束組織變褐、黑化壞死（圖1d）。

圖1 燈籠紅香瓜枯萎病癥狀

2.2 燈籠紅香瓜枯萎病病原菌分離

通過組織分離法分離獲得菌株（TG2）后，將分離菌株在PDA平板上培養(yǎng)6 d。觀察菌落呈圓形。菌落生長速率為10 mm/d，氣生菌絲呈白色，菌株菌絲體為淡紫色棉絮狀﹑濃密，菌落底色呈微紫色（圖2）。小型分生孢子長橢圓形或紡錘形，無色透明，大?。?.0～19.5）μm×（2.0～3.9）μm。該菌株與鐮刀菌屬（Fusarium）真菌的形態(tài)特征相同。

圖2 病原菌菌落、菌絲和孢子形態(tài)

2.3 病原菌回接鑒定

將上述分離的病原菌分離物采取人工接種的方法回接到健康的燈籠紅香瓜幼苗植株上（圖3a）。接種后第17天，接種病原菌的植株葉片萎蔫，根莖基部變黑和壞死。這些癥狀與田間采樣的植株表現(xiàn)一致（圖3b、圖3c、圖3d）。從回接的甜瓜植株上再次分離出與接種菌株相同的病原菌（圖3e、圖3f），完成了柯赫氏法則驗證該病原菌即為燈籠紅香瓜枯萎病的致病菌。

圖3 病原菌回接燈籠紅香瓜幼苗的癥狀表現(xiàn)和再次分離菌株形態(tài)

2.4 病原菌的分子鑒定

采用通用引物ITS1/ITS4對燈籠紅香瓜枯萎病病原菌（TG2）進行PCR擴增，獲得了長度為576 bp片段。純化后進行測序分析。將上述序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列BLAST比對。選擇近緣序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）。結(jié)果表明，TG2與Fusarium oxysporum聚在一枝上。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析確定TG2為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

圖4 基于ITS序列的分離菌TG2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 不同藥劑對燈籠紅香瓜枯萎病防治效果

由圖5可知，陽性對照的健康植株地上部葉片正常，地下部根系呈白色；陰性對照的處理根系黑化壞死，葉片萎蔫程度嚴重；藥劑處理后的植株地上部葉片有褪綠，少量葉片壞死，地下部褐變程度較輕。由表1可知，蛇床子素與植物免疫誘抗劑JM2的防治效果較好，防治效果分別為65.28%、61.43%；植物免疫誘抗劑JM1的防治效果為45.99%。此外，蛇床子素的病情指數(shù)最低，為25.00，說明不同藥劑在一定程度上降低了植物受病原菌侵染破壞的程度。

表1 4種藥劑對燈籠紅香瓜枯萎病的防治效果

圖5 4種藥劑對燈籠紅香瓜枯萎病的防治效果

3 討論與結(jié)論

瓜類枯萎病是香瓜上最重要的侵染性病害。本研究從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣采集燈籠紅香瓜發(fā)病樣品，分離得到病原菌TG2。通過病原菌形態(tài)觀察及其ITS序列分析，鑒定燈籠紅香瓜病害的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。在美國，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起加利福尼亞州中央山谷周圍甜瓜枯萎病的主要病原菌[17]。延涵等[18]報道了引起東北地區(qū)甜瓜枯萎病的病原菌是尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。黃文楓等[19]報道尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起了海南薄皮甜瓜枯萎病。香瓜枯萎病病原菌一旦發(fā)生大面積侵染很難根治，病原菌有性階段產(chǎn)生的厚垣孢子可長時間存活，宜早發(fā)現(xiàn)早防控。本研究首次在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣發(fā)現(xiàn)并鑒定甜瓜枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。苗丹等[20]研究發(fā)現(xiàn)，植物源藥劑對馬鈴薯枯萎病的防治效果較好，抑菌效果達69.3%。MASI等[21]對于藥用植物積雪草提取物的研究發(fā)現(xiàn)，除了三萜類成分約占提取物重量的45%，還發(fā)現(xiàn)了前所未有的 2α、3β、6β、23-四羥基油酸-13（18）-的新型三糖苷皂和異端胺酸。ZHANG等[22]從披針葉野決明（Thermopsis lanceolata R.Br.）的種子中分離出7種生物堿類化合物，其中一種可以顯著抗番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV），另外一種對蠶豆蚜有很好的殺蟲效果。以上研究結(jié)果說明對病蟲害起抑制作用的藥用物質(zhì)不止一種，或者一種植物的多種分離物質(zhì)同時作用才會有藥用價值。本研究中使用的植物免疫誘抗劑是由多種藥用植物熬制而成，說明起到防治枯萎病作用的不止一種物質(zhì)，或者是多種抑制物質(zhì)同時作用形成防治效果。但防治機制尚不清楚，還需要進一步研究。本研究表明，供試的植物免疫誘抗劑JM1、JM2、JM3和植物源藥劑蛇床子素具有一定的防治效果，均在一定程度上抑制了香瓜枯萎病病原菌侵染，該研究結(jié)果可為燈籠紅香瓜枯萎病的綠色防控提供參考。