荔浦芋球蛋白結構表征及其對HepG2 細胞糖代謝的影響

馬二蘭，張 帆，呂春秋，涂 連，王偉良，林 瑩,

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004；2.南寧海關技術中心，廣西南寧 530021）

芋頭（Taro,Colocasia esculenta（L.） Schott.）俗名芋艿，天南星科魁芋屬多年生草本植物。芋頭分為魁芋、魁子兼用芋、多子芋和多頭芋等，荔浦芋屬于魁芋類。荔浦芋為廣西特產(chǎn)，芋頭蛋白屬于塊莖類蛋白，球蛋白占可溶性蛋白的80%左右，球蛋白相對分子量較低，與很多生物學活性相關。芋頭的血糖生成指數(shù)值（Glycemic Index,GI）僅為47.7 左右，低于山藥（54）和土豆（66.4），但其淀粉含量高，因此推測芋頭中可能存在糖苷酶影響的活性物質，而球蛋白與很多生物活性相關，芋頭球蛋白對糖代謝影響及機理研究具有重要意義[1]。芋頭蛋白具有抗氧化[2?3]、免疫調節(jié)[4?6]、抗腫瘤[7?8]、抗真菌[9?11]和血糖調節(jié)[12]等活性，一般采用α-淀粉酶抑制活性初步研究其血糖調節(jié)活性。McEwan 等[13]純化得到兩種α-淀粉酶抑制劑，能抑制動物來源的α-淀粉酶而不能抑制真菌淀粉酶。Seltzer 等[14]純化得一種糖蛋白，相對分子量11.80 kDa，pI=4.40，具有α-淀粉酶抑制活性。Kumari等[12]純化出一種糖蛋白，相對分子量13.90 kDa，發(fā)現(xiàn)其能抑制α-淀粉酶，最適pH 為6.90，70 ℃時保持81.50%的活性，可以抑制人的唾液α-淀粉酶和α-馬鈴薯淀粉酶。

胰島素抵抗（Insulin Resistance，簡稱IR）是指機體內細胞對內源性或外源性胰島素敏感性降低，導致外周靶組織對葡萄糖吸收效率下降的一種病理狀態(tài)[15]。HepG2 源于人的肝胚胎瘤細胞，保留了肝細胞的特征與功能，是體外研究胰島素抵抗和糖代謝的理想模型[16]。糖原是葡萄糖的儲存形式，HK 和PK是糖酵解的限速酶，螺旋藻蛋白質能極顯著提高胰島素抵抗HepG2 細胞的己糖激酶（Hexokinase，HK）和丙酮酸激（Pyruvate Kinase，PK）活性，通過促進糖酵解來調節(jié)糖代謝[17]，可以通過葡萄糖消耗量，肝糖原合成量、己糖激酶和丙酮酸激酶活性表征活性物質對糖代謝功能影響的機制。

本課題前期采用0.10 mol/L 的磷酸緩沖液（含0.30 mol/L NaCl，pH=6.8）提取、硫酸銨分離和DEAE-52 離子交換層析法純化得到一種純度93.27%±0.62%的球蛋白，分子量為22.00 kDa，等電點5.6±0.2，具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，表現(xiàn)出一定的血糖調節(jié)潛力[18]。本文在此基礎上對該球蛋白二級結構進行鑒定，并以葡萄糖消耗量、肝糖原含量、HK 和PK 活性為指標，首次闡明其對IR-HepG2 細胞血糖調節(jié)的影響機理，有助于進一步理解荔浦芋球蛋白調節(jié)血糖的潛在機制，為荔浦芋球蛋白的活性研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔浦芋球蛋白 前期實驗提取純化所得[18]；HepG2 細胞株、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗100×）武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM 高糖基礎培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶 比利時BI 公司；胎牛血清（FBS） 浙江天杭生物科技股份有限公司；Cell Counting Kit 8 試劑盒 新賽美生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍 上海麥克林生化科技有限公司；非變性組織/細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；胰島素、葡萄糖含量檢測試劑盒 翼飛雪生物科技有限公司；糖原測定試劑盒、PK 測定試劑盒、HK 測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

DSC200PC 差式掃描量熱儀 德國耐馳儀器公司；NicoletiS10 傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱點公司；MOS-450 圓二色譜儀 法國CBIO-LOGIN 公司；L8900 高速氨基酸分析儀 日本HITACHI 公司；CLM-240B-8-CN 二氧化碳培養(yǎng)箱 新加坡Esco公司；Infinite M200pro 酶標儀 奧地利TECEN 公司；CKX41SF 倒置顯微鏡 日本OLYMPUS 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 球蛋白的差式掃描量熱分析 采用差示掃描量熱法測定球蛋白的熱穩(wěn)定性[19]。稱取5.00 mg 球蛋白，裝在坩堝中測定TP和△H 變化。儀器設置條件為：氮氣氣流量20 L/min，掃描溫度范圍25～150 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.2.2 球蛋白二級結構鑒定

1.2.2.1 圓二色譜測定 參照Sharma 等[20]的方法，配制0.25 mg/mL 的球蛋白溶液，吸取適量注入1 mm光徑比色皿中，采用圓二色譜儀在190～260 nm 范圍掃描。

1.2.2.2 紅外光譜測定 參照孫佳銳等[21]的方法，將球蛋白與溴化鉀混合研磨、壓片，在4000～500 cm?1范圍內掃描。

1.2.3 球蛋白氨基酸組成的測定 參照陳文等[22]的方法，采用氨基酸自動分析儀測定，稱取50.00 mg 球蛋白，酸水解后處理后過0.45 μm 濾膜，上樣進行氨基酸分析，并以純化前的粗蛋白進行對照分析氨基酸含量變化。

1.2.4 球蛋白對IR-HepG2 細胞糖代謝的影響

1.2.4.1 HepG2 細胞的培養(yǎng) 細胞復蘇后，收集細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、濕度適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和密度，培養(yǎng)至匯合度90%后，用胰酶消化3～5 min，每2 d 按1:3 傳代一次。

1.2.4.2 胰島素抵抗細胞模型的建立 調整細胞濃度為1×105cell/mL，接種于96 孔板（200 μL/孔），培養(yǎng)至70%細胞匯合度，加入含濃度為10?5、10?6、10?7、10?8、10?9mol/L 的胰島素培養(yǎng)24 h 和10?7mol/L 胰島素作用12、24、36 h 和48 h，按照葡萄糖含量檢測試劑盒說明書測定葡萄糖消耗量△GC，△GC＝對照組細胞葡萄糖含量-樣品組細胞葡萄糖含量。倒置顯微鏡下觀察IR-HepG2 細胞形態(tài)特征和生長狀態(tài)。

采用CCK8 法校正因細胞數(shù)量造成測定的結果差異。細胞活力的測定：按照試劑盒說明采用Cell Counting Kit 8（CCK8）法測定，計算細胞存活率，細胞存活率（%）=樣品組細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)×100。細胞數(shù)量標準曲線為：y=0.0131x+0.1895，R2=0.9970，其中，y 為細胞濃度，單位1×104cell/mL，x 為OD450nm。

1.2.4.3 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響 細胞復蘇后于96 孔板培養(yǎng)24 h 后，對照組加培養(yǎng)基，模型組采用10?7mol/L 胰島素作用36 h 造模，每孔200 μL，模型組又分為二甲雙胍（30 μg/mL）組和荔浦芋球蛋白高（500 μg/mL）、中（300 μg/mL）、低（100 μg/mL）劑量組[23]，繼續(xù)分別加入200 μL 二甲雙胍和相應濃度球蛋白，作用24 h后，測葡萄糖含量，計算△GC，葡萄糖消耗增加率（%）=（△GC樣品組?△GC模型組）/△GC模型組×100。

1.2.4.4 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞肝糖原合成量和HK、PK 活性的影響 細胞復蘇后于6 孔板培養(yǎng)24 h 后，對照組加培養(yǎng)基，模型組采用10?7mol/L胰島素作用36 h 造模，每孔2 mL，按1.2.4.3 的方法加樣2.00 mL，作用24 h 后，胰酶消化，收集細胞，采用裂解液裂解細胞，12000 r/min 在4 ℃離心5 min收集上清置于冰浴中，采用BCA 試劑盒法測定蛋白質濃度，按試劑盒說明書測肝糖原含量和HK、PK 活性，肝糖原合成增加率（%）=（樣品組肝糖原含量?模型組肝糖原含量）/模型組肝糖原含量×100，酶活性增加率（%）=（樣品組酶活性?模型組酶活性）/模型組酶活性×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式，每組做三個平行，采用SPSS 17.0、Excel 2010 和Origin 8.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，圓二色譜數(shù)據(jù)采用Peakfit 擬合軟件和CDNN 軟件分析，紅外數(shù)據(jù)處理采用OMNIC 和Peakfit 擬合軟件分析。

2 結果與分析

2.1 荔浦芋球蛋白的差式掃描量熱分析

蛋白質的熱穩(wěn)定性可以用熱變性溫度TP和誘導變性所需要的能量焓值ΔH 來表示。ΔH 可以反映出蛋白分子的疏水性和親水性以及聚集程度，與蛋白的二級結構有關，ΔH 越大，表明蛋白親水性和分子聚集度越高。在一定的升溫或降溫過程中，采用差示掃描量熱儀對荔浦芋球蛋白質的熱效應進行測定，可以間接反應蛋白質的結構及其所處的狀態(tài)。從圖1 中可以看出，荔浦芋球蛋白的變性溫度為79.30±1.36 ℃，ΔH 為7.46±0.53 J/g，變性溫度高說明蛋白具有較強的溫度耐受性，親水性和分子聚集度高，變性焓較高，說明球蛋白中有序結構所占比例較大。

圖1 荔浦芋球蛋白的差示掃描量熱曲線Fig.1 Thermal denaturation curve of Lipu taro globulin

2.2 荔浦芋球蛋白的二級結構鑒定

2.2.1 圓二色譜分析 荔浦芋球蛋白的圓二色譜如圖2 所示，在209 nm 附近有負的最大吸收峰，為β-折疊的特征負吸收峰，不存在α-螺旋的雙負槽峰，因此可以推測球蛋白含有大量的β-折疊以及少量無規(guī)卷曲，少量或不含α-螺旋。利用CDNN 軟件計算荔浦芋球蛋白的二級結構含量：α-螺旋為8.12%，β-折疊為42.61%，無規(guī)卷曲為29.05%，β-轉角為20.22%。

圖2 荔浦芋球蛋白的圓二色譜圖Fig.2 Circular dichroism of Lipu taro globulin

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 通過分析荔浦芋球蛋白的紅外光譜圖（圖3 示），在1402 cm?1處的吸收比1539 cm?1的強，它們分別是-HN-C=O 的順式和反式結構的吸收峰，且順式構型能量比反式構型高，穩(wěn)定性差，因此，表明荔浦芋球蛋白天然結構可能在旋蒸濃縮或硫酸銨分離過程中遭到了一定程度地破壞，1643 cm?1處的吸收峰表明球蛋白中含有C=O 伸縮振動。

圖3 荔浦芋球蛋白的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of Lipu taro globulin

由表1 可以得到荔浦芋球蛋白吸收峰的歸屬，一般蛋白質的二級結構主要受酰胺I 區(qū)和酰胺III 區(qū)的影響，因此，采用Peakfit 擬合軟件對荔浦芋球蛋白紅外光譜的酰胺I 區(qū)和酰胺III 區(qū)進行二階導數(shù)去卷曲和曲線擬合，進行多次擬合使殘差最小，使重疊的圖譜可以完全分開而有利于分辨，各個波長與其結構對照關系計算蛋白質二級結構比例。

表1 荔浦芋球蛋白的酰胺基團特征振動[24]Table 1 Characteristic vibration of amide groups of Lipu taro globulin[24]

由表2 可知，荔浦芋球蛋白二級結構包括：5.04%～13.27%的α-螺旋，39.42%～42.14%的β-折疊，18.25%～24.16%的β-轉角，26.34%～31.38%的無規(guī)卷曲。二級結構與圓二色譜略有差異，但趨勢一致，含量由高到低依次是β-折疊、無規(guī)卷曲、β-轉角、α-螺旋。

表2 荔浦芋球蛋白二級結構組成Table 2 Secondary structure composition of Lipu taro globulin

2.2.3 荔浦芋球蛋白氨基酸組成分析 荔浦芋球蛋白和粗蛋白的氨基酸組成如表3 所示。荔浦芋球蛋白中含量最高的三種氨基酸均為天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸，純化后分別占總氨基酸的17.70%、11.35%、10.39%，其中天冬氨酸和谷氨酸屬于酸性氨基酸。

荔浦芋球蛋白必需氨基酸組成評價如表4，球蛋白的氨基酸評分為103.10%，必需氨基酸含量符合FAO/WHO 成人推薦標準。

表4 荔浦芋球蛋白必需氨基酸組成評價Table 4 Evaluation of essential amino acid composition of Lipu taro globlin

脯氨酸（Pro）和丙氨酸（Ala）等與抑制二肽基肽酶-IV（DPP-IV）活性有關，能抑制碳水化合物水解生成葡萄糖[25]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性受Leu 和Pro 這兩種疏水氨基酸影響[26]?；钚噪闹械母彼峥赡芡ㄟ^影響肽的柔韌性增加其與α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的結合力[27]，脯氨酸在碳末端區(qū)域的存在是有效肽抑制劑的一個共同特征，也有報道保護肽免受蛋白水解[28]，亮氨酸被認為是通過代謝變構激活和/或膜去極化來增強胰島素分泌的關鍵，碳末端精氨酸對多肽的抑制活性有積極作用[29]。

2.2.4 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞糖代謝的影響

2.2.4.1 胰島素抵抗細胞模型的建立 由表5 可知，在胰島素濃度為1×10?7mol/L 時，細胞葡萄糖消耗最低，表明此時細胞處于胰島素抵抗狀態(tài)，顯著減少了葡萄糖的吸收。

表5 不同胰島素濃度作用24 h 后細胞的葡萄糖消耗量Table 5 Glucose consumption of cells exposed to different insulin concentrations for 24 h

由表6 可知，與對照組相比，36 h 之前葡萄糖消耗量有顯著差異，在36 h 處差異達到最大，而48 h時雖然葡萄糖消耗量差異大，但其細胞存活率顯著降低，因此胰島素作用時間選擇36 h。

表6 1×10?7 mol/L 胰島素作用不同時間后葡萄糖消耗量Table 6 Glucose consumption of cells after 1×10?7 mol/L insulin treatment for different time

2.2.4.2 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響 由表7 可知，與對照組相比，模型組的葡萄糖消耗量顯著降低，表明造模成功，可用于進一步研究，二甲雙胍組和球蛋白組糖消耗量明顯大于模型組，隨球蛋白濃度的增加葡萄糖消耗量也增加，說明在該濃度范圍內，葡萄糖消耗與荔浦芋球蛋白存在量效關系。當球蛋白濃度達到500 μg/mL 時，葡萄糖消耗增加率達到40.62%±0.98%，陽性對照62.89%±0.71%，說明荔浦芋球蛋白能促進IR-HepG2 對葡萄糖的消耗。CCK8 檢測結果顯示，當球蛋白濃度為500 μg/mL，對細胞的抑制率接近20%，說明高濃度球蛋白會抑制細胞生長繁殖或對細胞造成損傷。

表7 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響Table 7 Effect of Lipu taro globuline on glucose consumption in IR-HepG2 cells

2.2.4.3 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞肝糖原合成量和HK、PK 活性的影響 由表8 可知，模型組的肝糖原合成量和HK、PK 活性均顯著小于對照組（P<0.01），表明造模成功。與模型組相比，二甲雙胍能極顯著增加肝糖原合成量和HK、PK 活性（P<0.01）；荔浦芋球蛋白極顯著增加肝糖原合成量，最高可以增加28.80%±1.26%，能顯著增加PK 活性（P<0.01），最高可以增加44.29%±2.64%，能顯著增加HK活性（P<0.01），最高可以增加54.63%±2.48%?？喙系鞍自鰪娞悄虿〈笫驢K 的活性[30]，馬鹿鹿角蛋白顯著提高了糖尿病小鼠肝臟中HK 和PK 的活性[31]，鮮味多肽顯著提高小鼠的葡萄糖消耗量、HK 和PK 活性[32]，螺旋藻蛋白質能極顯著提高胰島素抵抗HepG2細胞的HK 和PK 活性[33]。綜上，活性蛋白作用于細胞表面受體通過改善胰島素信號通路，促進葡萄糖轉化為肝糖原，同時增強HK 和PK 活性，通過增強糖酵解途徑調節(jié)糖代謝。

表8 荔浦芋球蛋白對IR-HepG2 細胞肝糖原合成量、HK 和PK 活性的影響Table 8 Effect of Lipu taro globuline on liver glycogen synthesis,activity of HK and PK in IR-HepG2 cells

綜上，荔浦芋球蛋白能增加IR-HepG2 細胞的肝糖原合成量，提高HK、PK 活性，可能是通過調節(jié)糖酵解緩解因胰島素抵抗導致的葡萄糖吸收減少的情況，對于餐后血糖的調節(jié)具有指導意義。

3 結論

荔浦芋球蛋白變性溫度為79.30±1.36 ℃，對應焓值為7.46±0.53 J/g，二級結構組成含量為：β-折疊39.42%～42.14%，無規(guī)卷曲26.34%～31.38%，β-轉角18.25%～24.16%，α-螺旋5.04%～13.27%。該球蛋白富含天冬氨酸和谷氨酸，符合一般植物貯藏蛋白的規(guī)律，氨基酸評分為103.10%，必需氨基酸含量符合FAO/WHO 成人推薦標準。

本研究首次鑒定荔浦芋球蛋白二級結構，并以IR-HepG2 細胞模型探究其對糖代謝的影響，球蛋白濃度為500 μg/mL 時，葡萄糖消耗量增加40.62%±0.98%，肝糖原合成增加率為26.35%±1.13%，PK 活性增加率為44.29%±2.64%，HK 活性增加率為54.63%±2.48%，初步證明其可以通過促進葡萄糖吸收、增加肝糖原合成和增強糖酵解影響糖代謝，能顯著改善胰島素抵抗導致的葡糖糖吸收障礙。綜上，荔浦芋球蛋白可能是通過作用于細胞表面通過胰島素信號通路促進胰島素分泌、增加肝糖原合成和增強糖酵解來影響糖代謝，其具體的作用機制需要研究胰島素抵抗信號通路中相關基因和蛋白的表達來驗證，在后續(xù)動物實驗和應用于功能食品中時，可以通過微膠囊化等技術對蛋白進行包埋使其避開胃腸道消化達到靶器官再發(fā)揮作用。