牛蒡多糖特性分析及對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)作用

朱姍姍，張 斌，朱文卿，陳 鏘，張超杰，鄭振佳,

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安 271018；2.山東博德醫(yī)藥研究院有限公司，山東德州 253084）

牛蒡（Arctium lappaL.）為藥食同源的兩年生菊科植物，作為食用蔬菜被廣泛種植[1?2]。目前種植的主要品種有：東京理想、東京白肌、柳川理想、白肌大長以及地皇早生等，牛蒡中含有多糖、萜酸、酚類、蛋白質(zhì)以及黃酮類等多種活性成分[3?5]，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性[6?8]。多糖是牛蒡中含量較高的成分，具有多種生物活性如抗炎、抗氧化以及降血糖等[9]。

炎癥是由多種促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)誘導(dǎo)的復(fù)雜病理現(xiàn)象，是機體對于組織損傷或致病因子侵入做出的一種防御反應(yīng)[10]。研究表明，炎癥因子異常激活將引發(fā)各種疾病[11]，其中，NO、TNF-α、IL-1β和NFкB2 等作為重要的炎癥因子，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面起到重要作用[12]。合成的抗炎藥物通常具有一定的副作用，因此，開發(fā)基于食物來源的低副作用抗炎藥物十分必要，牛蒡多糖具有一定的抗炎效果，但其特性及體外消化情況研究較少。

本實驗以柳川理想牛蒡為研究對象，采用熱水回流法提取多糖，通過紫外光譜、紅外光譜以及離子色譜進(jìn)行分析，研究了其單糖組成及體外消化特性并利用細(xì)胞抗炎模型對牛蒡多糖的抗炎活性進(jìn)行評價，以期為牛蒡資源的合理開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡干切片 江蘇沛縣軼偉有限公司，品種為柳川理想牛蒡；胎牛血清 美國Sigma 公司；雙抗索萊寶科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS 大連美侖生物技術(shù)有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒中國南京建成生物工程研究所（A012-1-2）；脂多糖（LPS） 北京索萊寶科技有限公司；胃液、腸液、葡聚糖（180、342、1000、2000、3000、5000、7000、9000 Da）以及單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸） 上海源葉生物科技有限公司；RAW.264.7 細(xì)胞 美國模式培養(yǎng)物集存庫；氯化鈉（NaCl） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（NaOH） 天津市巴斯夫化工有限公司；鹽酸（HCl）萊陽市康德化工有限公司。

IE204E 型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；ICS-5000 離子色譜儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱美國賽默飛世爾科技有限公司；酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；SCIENTZ-18ND 真空冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；Zetasizer-Nano-ZS 激光納米粒度分析儀 英國Malvern 公司；LC-20A 高效液相色譜儀 日本島津儀器有限公司；ST 2100 酸度計常州奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛蒡多糖的提取與純化

1.2.1.1 牛蒡多糖的提取 采用熱水回流法從牛蒡中提取多糖[13?14]。牛蒡粉碎后過60 目篩，80 ℃水提（10:1，v/w）兩次，每次1.5 h，將合并的上清液于55 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至體積的1/3。

1.2.1.2 牛蒡多糖的純化 多糖提取液經(jīng)等體積的石油醚萃取脫脂，水相再經(jīng)乙酸乙酯對多酚等組分進(jìn)行脫除，最后采用Sevag 法脫除水相中的蛋白質(zhì)，以糖溶液:氯仿-正丁醇（4:1）為1:4 混合，充分振搖后離心（3000 r/min，15 min），棄去下層不溶性物質(zhì)，重復(fù)萃取5～7 次，直至無變性蛋白層，將上清液濃縮至1/3 體積，加入4 倍體積的無水乙醇沉淀24 h，將沉淀部分復(fù)溶，濃縮至1/3 體積后進(jìn)行透析（截取30 cm長度透析袋，用蒸餾水煮沸5 min 后，用60 ℃蒸餾水洗沖2 min，置4 ℃蒸餾水中待用，將濃縮后的多糖樣品溶液放入截留分子量為500 Da 的透析袋中，透析48 h，每4 h 更換一次蒸餾水），將透析后溶液放于?18 ℃保存后冷凍干燥48 h，得牛蒡多糖（苯酚硫酸法[15]測得糖含量為83.07%）。

1.2.2 紫外光譜分析 配制牛蒡多糖（1 mg/mL）溶液，進(jìn)行紫外-可見全波長掃描[16]。

1.2.3 多糖分子量的測定 采用高效液相色譜法分析消化過程中多糖分子量，色譜柱為Shodex OHpak SB-802 HQ、802.5 HQ 和803 HQ 串聯(lián)，以0.3 mol/L NaNO3為流動相，0.3 mL/min 為流速，進(jìn)樣量20 μL，柱溫為30 ℃，以系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)。配制5 mg/mL 的牛蒡多糖樣品，用0.22 μm 的水系濾頭過濾，實驗重復(fù)三次。

1.2.4 紅外光譜分析 采用傅里葉紅外光譜（FTIR）對多糖進(jìn)行分析[11]。掃描范圍為4000～500 cm?1，分辨率為4 cm?1，重復(fù)三次。

1.2.5 單糖組成的測定 采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法對牛蒡多糖進(jìn)行測定，分別用不同濃度的單糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對牛蒡多糖中單糖組成進(jìn)行定性及定量分析[17]。在含有2 mL 三氟乙酸（TFA）的試管中在80 ℃下水解10 mg 多糖粉末6 h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)用于去除殘留的TFA。用超純水將樣品體積調(diào)節(jié)至10 mL 后，在Supelclean? ENVI-18 SPE管（30 mg/mL）和0.22 μm 微孔過濾器上進(jìn)行純化。使 用Dionex? AminoPac? PA10 IC 柱（Dionex，3 mm×250 mm）進(jìn)行分析，使用0.20 mol/L NaOH 溶液和1.00 mol/L 醋酸鈉溶液作為流動相，柱溫設(shè)置為30 °C，最小流量設(shè)置為0.25 mL。

1.2.6 牛蒡多糖的物理穩(wěn)定性

1.2.6.1 pH 對多糖穩(wěn)定性的影響 通過添加不同量的0.5 mol/L HCl 或NaOH 將制備的多糖溶液調(diào)節(jié)至所需的pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0），4 ℃條件下儲存24 h 后對其粒徑進(jìn)行測量[18]。

1.2.6.2 NaCl 濃度對多糖穩(wěn)定性的影響 通過添加不同質(zhì)量的NaCl 以獲得具有不同濃度（0、50、100、150 和200 mmol/L）的多糖溶液。4 ℃條件下儲存24 h 后對其粒徑進(jìn)行測量[18]。

1.2.6.3 溫度對多糖穩(wěn)定性的影響 將新制備的多糖溶液分別放置于30、40、50、60、70、80 和90 ℃環(huán)境條件中1 h 后取出放涼至室溫，分別取1 mL 溶液放入馬爾文激光粒度儀進(jìn)行粒徑的測定[18]。

1.2.7 體外模擬胃腸道消化 參考文獻(xiàn)[19]報道的體外消化方法稍作修改。

胃液消化：將牛蒡多糖（10 mg/mL）的濃度和模擬人工胃液以1:1（v/v）的比例加入離心管中，使用0.5 mol/L 的HCl 和NaOH 將混合物 的pH 調(diào)節(jié)至2.0。在37 ℃的恒溫水浴搖床中孵育（150 r/min），模擬胃部消化；隨后分別在1、2、6 h 時取樣2 mL，將混合物pH 調(diào)至7.0，沸水浴5 min 終止反應(yīng)。

腸道消化：將胃部消化的混合物和模擬人工腸液以10:3（v/v）的比例加入離心管中，使用0.5 mol/L的HCl 和NaCl 將混合物的pH 調(diào)節(jié)至7.0。在37 ℃的恒溫水浴搖床中孵育（150 r/min），模擬腸部消化；分別在1、2、6 h 時取樣2 mL，沸水浴5 min 終止反應(yīng)。

對體外消化過程中不同階段取得的樣本的還原糖含量進(jìn)行檢測并計算牛蒡多糖在胃腸道內(nèi)的水解度。采用苯酚硫酸法測定總糖含量，使用2,5-二硝基水楊酸測定還原糖含量。多糖水解度計算公式為：

公式中：Rt—樣品溶液在各測試時間點的還原糖含量（mg/mL，t=1、2、6 h）；Ro—樣品溶液的初始還原糖含量（mg/mL）；Ts—樣品溶液中的總糖含量（mg/mL）。

1.2.8 細(xì)胞模型抗炎活性評價

1.2.8.1 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng) 將巨噬細(xì)胞RAW 264.7 接種在含有10%FBS 胎牛血清、1%雙抗（鏈霉素100 mg/mL、青霉素100 U/mL）和90% DMEM完全培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中，于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)，24～36 h 后對細(xì)胞進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)瓶的70%～80%時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.8.2 RAW264.7 細(xì)胞活力測試 在96 孔板中加入8×104個/mL 的對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞于培養(yǎng)箱中孵育24 h，設(shè)置實驗組和正常對照組，于培養(yǎng)箱處理12 h，實驗組即加入不同濃度的多糖溶液（以PBS 溶液配制200 mg/mL 的母液，用培養(yǎng)基稀釋成50、100、250、500、1000 μg/mL）。隨后每孔加入100 μL CCK-8（Cell Counting Kit-8 細(xì)胞計數(shù)試劑），培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h 后，于450 nm 測定吸光度（A），實驗進(jìn)行三次重復(fù)，細(xì)胞活力計算如下：

1.2.8.3 RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型的建立 收集對數(shù)生長期的RAW 264.7 細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞沉淀制成含8×104個/mL 的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板?？瞻捉M加入100 μL DMEM 高糖培養(yǎng)基；對照組中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液和100 μL 完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，再加入100 μL 完全培養(yǎng)基；實驗組中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液和100 μL 完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 不同濃度的LPS 溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL）。最后各組均在培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，收集細(xì)胞上清液測定NO 含量，以此來篩選LPS 濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.8.4 多糖對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 含量的影響 在96 孔板中加入100 μL 8×104個/mL 對數(shù)期生長的RAW 264.7 細(xì)胞和100 μL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育24 h 后去除培養(yǎng)基，然后加入不同濃度（50、100、250、500 μg/mL）的多糖溶液100 μL孵育12 h，再加入篩選后的LPS 溶液（LPS，1 μg/mL）100 μL 處理24 h，同時設(shè)置空白組（只加培養(yǎng)基）和對照組（不加樣品干預(yù)處理）。培養(yǎng)結(jié)束后收集上清液，參照NO 試劑盒說明書推算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗采用Origin 9.1 和GraphPad Prism 8 軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)三次，通過SPSS 軟件進(jìn)行t 檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

牛蒡粗多糖的紫外光譜圖如圖1 所示，在波長260、280 nm 下沒有明顯吸收峰，說明該牛蒡粗多糖組分中幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)。

圖1 牛蒡多糖的紫外光譜分析Fig.1 Ultraviolet spectrum analysis of burdock polysaccharide

2.2 分子量測定

采用高效液相色譜法對牛蒡多糖進(jìn)行分子量測定（如圖2），以標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量對數(shù)值為縱坐標(biāo)，保留時間為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=?3.145826e?005X3+0.007674452X2?0.6716573X+23.53052，R2=0.9900413。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖樣品的分子量，結(jié)果顯示其重均分子量為2902 Da，占比98.68%，通過分析圖可以發(fā)現(xiàn)牛蒡多糖中雜質(zhì)較少。

圖2 牛蒡多糖的分子量測定圖Fig.2 Diagram of molecular weight determination of burdock polysaccharide

2.3 紅外光譜分析

圖3 顯示了牛蒡多糖的典型紅外譜圖：其中，3290 cm?1處的峰屬于O-H 的伸縮振動，2930 cm?1處的吸收峰屬于包括-CH、-CH2和-CH3基團(tuán)在內(nèi)的C-H 的伸縮振動，1630 cm?1和1420 cm?1的峰分別對應(yīng)于對稱的C=O 伸縮振動以及不對稱的C=O 的伸縮振動和C-H 的彎曲振動[20]。C-O-H 和C-O-C 的伸縮振動引起從1200 cm?1到1000 cm?1處的吸收[21]，1000～800 cm?1處的吸收帶為呋喃糖殘留物的特征峰，其中，933 cm?1處的吸收峰對應(yīng)于呋喃糖環(huán)對稱伸縮振動，819 cm?1處的吸收峰為糖分子中呋喃環(huán)的C-H 鍵的變角振動吸收，說明該牛蒡多糖為含有呋喃環(huán)的糖[22?24]。該研究結(jié)果與李丹丹[25]所制備的牛蒡菊糖紅外光譜結(jié)果相一致，均為含有呋喃環(huán)的多糖。

圖3 牛蒡多糖的紅外光譜分析圖Fig.3 Infrared spectrum analysis chart of burdock polysaccharide

2.4 單糖組成測定

從圖4 中可以看出牛蒡粗多糖中果糖含量最高，且果糖:葡萄糖:阿拉伯糖:半乳糖=13.6:2.5:1.6:1，不含有糖醛酸，該結(jié)果與紅外光譜中不含糖醛酸特征峰結(jié)果一致。此外，單糖結(jié)果顯示果糖為牛蒡多糖中的主要單糖。Jiang 等[26]對牛蒡多糖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其單糖組成主要由甘露糖、葡萄糖、果糖和半乳糖組成，但三種純化多糖組分（對應(yīng)分子量分別為218、178 和60 kDa）之間單糖所占比例不同。圖中保留時間為6 min 附近的峰在巖藻糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸6 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品中均未有對應(yīng)，有待進(jìn)一步分析驗證。

圖4 牛蒡多糖的單糖組成Fig.4 The monosaccharide composition of burdock polysaccharide

2.5 物理穩(wěn)定性評價

粒徑是依據(jù)Stoke’s 定律評估體系穩(wěn)定性的常用方法，體系中顆粒的平均粒徑越大，體系越不穩(wěn)定[27]。由圖可知，不同的溫度條件（30、40、50、60、70、80、90 ℃）對多糖的粒徑及聚合物分散性指數(shù)（PDI）影響結(jié)果見圖5，均在277～343 nm 及0.374～0.425 范圍內(nèi)。多糖在pH 為2 時，粒徑極大，此時多糖溶液處于不穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)pH 為3～9 時，粒徑范圍在174～319 nm 之間，PDI 在0.353～0.473 之間，變化較小。多糖在NaCl 濃度為0～50 mmol/L 時，粒徑變化不大；而當(dāng)NaCl 濃度高于100 mmol/L 時粒徑達(dá)到1200 nm 以上，PDI 值大于0.6，該結(jié)果可能是因為NaCl 的加入減弱了靜電斥力，導(dǎo)致粒徑增加[28]。

圖5 牛蒡多糖物理穩(wěn)定性評價Fig.5 Physical stability evaluation of burdock polysaccharide

2.6 體外消化

由圖6 可知，牛蒡多糖經(jīng)胃腸道消化后隨著消化時間增加其水解度在逐步增加，其中，整個胃部消化（6 h）水解度為11.66%，還原糖含量增加，這可能與胃液的酸性環(huán)境使糖苷鍵斷裂或共價鍵的破壞導(dǎo)致還原末端的形成有關(guān)[29?32]。腸道消化階段多糖水解度繼續(xù)增加可能與小腸液中含有胰腺和肝臟分泌的胰酶和膽汁酸以及糖苷酶將多糖水解成單糖有關(guān)，但腸消化較胃消化階段水解度下降，腸消化水解度為9.12%，可能與腸液的稀釋有關(guān)[33]。

圖6 牛蒡多糖體外消化水解度變化Fig.6 Changes in the degree of digestion and hydrolysis of burdock polysaccharides in vitro

2.7 體外抗炎活性評價

2.7.1 細(xì)胞活力實驗 由圖7 可知，不同濃度（50、100、250、500、1000 μg/mL）的多糖作用于RAW264.7 細(xì)胞后，對照組和不同濃度的多糖組細(xì)胞存活率分別為：100%、100.22%、95.26%、89.41%、85.85%以及78.36%，與對照組相比不同濃度的多糖組對細(xì)胞存活率沒有明顯的抑制效果，表明牛蒡多糖對細(xì)胞幾乎沒有毒性。其中，多糖濃度為1000 μg/mL 時細(xì)胞存活率低于80%，不適合作為評價濃度，因此，選取50～500 μg/mL 無毒濃度作為后續(xù)實驗的濃度梯度。

圖7 不同濃度的多糖細(xì)胞活力Fig.7 Cell viability of different concentrations of polysaccharides

2.7.2 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型 LPS 濃度對NO 含量的影響如圖8 所示，經(jīng)過不同實驗濃度（0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL）LPS 處理后，均導(dǎo)致了NO 含量增加，且在0.1～1 μg/mL 范圍內(nèi)NO 含量隨LPS 誘導(dǎo)濃度的上升而增加，該結(jié)果表明在0.1～1 μg/mL 范圍內(nèi)LPS 濃度越高對細(xì)胞造成的炎癥越明顯。其中，LPS 濃度在0.1 和0.2 μg/mL 時，NO 含量與對照組無顯著性差異（P>0.05）；而當(dāng)濃度高于0.5 μg/mL 時，模型組NO 的含量與對照組表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05），在高濃度（1 μg/mL）時，實驗組NO 的含量高于對照組88.72%，但當(dāng)LPS 的濃度為2 μg/mL 時NO 的含量與1 μg/mL 時無顯著性差異（P>0.05），因此選擇LPS 終濃度為1 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖8 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型Fig.8 LPS-induced inflammation model of RAW264.7 cells

2.7.3 多糖對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 的影響 NO 含量的升高是RAW 264.7 細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志之一，因此研究不同濃度的多糖溶液對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞上清液中NO 含量的影響，可以作為評價藥物抗炎活性的指標(biāo)。由圖9 可知，與對照組相比，LPS（1 μg/mL）可以顯著增加RAW 264.7 細(xì)胞中的NO 含量（P<0.0001），NO 含量從3.75 μmol/L 增加至12.70 μmol/L，而與模型組相比，不同濃度的多糖可以顯著降低NO 的產(chǎn)生（P<0.05），使NO 的含量下降19.37%～48.66%，于250 μg/mL 時NO 的含量達(dá)到最低為6.52 μmol/L，效果明顯，而500 μg/mL 時NO 的含量出現(xiàn)輕微上升，可能是由于化合物活性與劑量的作用關(guān)系一般是拋物線型，因此高濃度（500 μg/mL）的多糖溶液的抗炎作用減弱，以上結(jié)果均證明了牛蒡多糖的抗炎效果。

圖9 多糖對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 的影響Fig.9 The effect of polysaccharides on NO in RAW264.7 cells induced by LPS

3 結(jié)論

牛蒡多糖的總糖含量為83.07%，分子量為2902 Da，單糖組成為果糖:葡萄糖:阿拉伯糖:半乳糖=13.6:2.5:1.6:1，結(jié)合紅外光譜分析牛蒡多糖為含有呋喃環(huán)的多糖。該多糖受溫度及pH（3～9）影響較小，但高鹽離子濃度會破壞其穩(wěn)定性。消化過程中還原糖含量增加，經(jīng)胃腸各消化6 h 后水解度為20.78%。由LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型中可以看出牛蒡多糖可以顯著降低NO 的水平（P<0.05），250 μg/mL 時NO 的含量達(dá)到最低為6.52 μmol/L，較模型組下降48.66%。綜上所述，本研究基于體內(nèi)外兩種模型同時證明了牛蒡多糖的抗炎效果，為天然抗炎產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，有利于牛蒡資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用。