響應(yīng)面法優(yōu)化草菇抗氧化肽的酶法制備工藝

王耀冉，陳明杰，查 磊，魏晨穎，李治平，趙 妍,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

草菇（Volvariella volvacea）隸屬真菌界、擔(dān)子菌門、傘菌目、光柄菇科、小苞腳菇屬[1]，是一種高價(jià)值食藥用真菌，味道鮮美，口感滑嫩，營養(yǎng)豐富，具有提高免疫力、抗癌和降壓等功效[2?5]。草菇中含有蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素和礦物質(zhì)等多種功能活性成分，其中，蛋白質(zhì)約占29%～41%（干重）[6?7]，是提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的合適來源。草菇人工栽培源自于中國，目前，我國是全球最大的草菇生產(chǎn)國[8]。當(dāng)前，對(duì)草菇的研究主要集中在草菇多糖和多酚等方面，如錢禮順[9]優(yōu)化了超聲輔助提取草菇子實(shí)體多糖工藝，通過進(jìn)一步分離純化，獲得一種新型的α-葡聚糖；Kalava等[10]發(fā)現(xiàn)草菇菌絲體水提物中的多酚具有清除自由基的能力。由于草菇蛋白酶解抗氧化肽研究相對(duì)較少，所以開展草菇蛋白深加工和高附加值的生物活性肽研究尤為必要。

多肽在抗氧化方面具有優(yōu)異的活性，是天然的抗氧化劑，能預(yù)防和減輕人體氧化應(yīng)激引發(fā)的衰老、免疫疾病及其他各類疾病[11?13]。當(dāng)前已有許多動(dòng)植物源抗氧化肽的報(bào)道，如毛蚶蛋白[14]、雞蛋清蛋白[15]和玉米蛋白[16]等。蛋白酶水解蛋白可將高分子的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為短鏈的多肽甚至是氨基酸，這些低分子量的多肽具有比原蛋白更高的生物活性[17]。而蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性取決于蛋白質(zhì)來源、蛋白酶類型，水解條件等[18?19]，因此選擇合適的條件水解蛋白具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)以草菇為原料，通過蛋白酶水解制備抗氧化肽。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，通過超濾分離純化最佳酶解條件下制備的抗氧化肽，并測定其體外抗氧化活性，旨在為草菇抗氧化肽制備提供科學(xué)依據(jù)，提高草菇蛋白綜合利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；堿性蛋白酶（200 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg） 上海麥克林生化科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；DPPH 自由基清除能力試劑盒 北京艾普希隆生物科技有限公司；甲醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Labconco Free Zone 冷凍干燥機(jī) 美國Labconco 公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；TECAN Infinite 200 Pro 多功能酶標(biāo)儀瑞士TECAN 公司；R-134 a 高速離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；Milli-Q Reference A+超純水機(jī) MerckMillipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草菇預(yù)處理 草菇子實(shí)體洗凈、切片、冷凍干燥、粉碎、過60 目篩，于?80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)提取工藝 將草菇粉與超純水按照1:10（w/v）的比例混勻，超聲（100 Hz）20 min，靜置4 h，8000 r/min 下離心留上清液，采用80%硫酸銨于4 ℃沉淀，離心（6000 r/min,20 min）留沉淀，將沉淀重新溶解在少量蒸餾水中。重新溶解的提取物使用10 kDa 的透析袋于4 ℃下用超純水透析48 h，凍干后保存于?80 ℃超低溫冰箱內(nèi)以備酶解使用。

1.2.3 酶解工藝流程 將草菇蛋白凍干粉按一定料液比加蒸餾水混勻，使用0.5 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)至酶最適的pH，在酶最適合的溫度平衡30 min，加酶，水浴酶解（使用0.5 mol/L 的NaOH 維持pH 恒定）。滅酶（90 ℃，15 min），冷卻后離心（4 ℃，8000 r/min，20 min），上清液凍干備用。

1.2.4 蛋白酶的篩選 選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性-中性蛋白酶（順序酶解：首先加入堿性蛋白酶水解2 h，滅酶，然后調(diào)節(jié)溫度和pH 至第二種酶最適值，平衡30 min，加入第二種蛋白酶，水解2 h，滅酶。其余同。），堿性-胰蛋白酶、堿性-木瓜蛋白酶，在它們最佳酶解條件下對(duì)草菇蛋白進(jìn)行酶解（表1），以DPPH 自由基清除率、Fe2+螯合能力和還原力作為指標(biāo)，篩選出合適的蛋白酶。

表1 不同酶酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions for the various enzymatic hydrolyses

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.4 篩選出的最適酶水解草菇蛋白制備抗氧化肽，以DPPH 自由基清除率作為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。固定加酶量4%，底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL，探究酶解時(shí)間1、2、3、4、5 h 對(duì)草菇蛋白酶解效果的影響；固定酶解時(shí)間4 h，底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL，探究加酶量2%、3%、4%、5%、6%對(duì)草菇蛋白酶解效果的影響；固定酶解時(shí)間4 h，加酶量4%，探究底物質(zhì)量濃度1、2、3、4、5 g/100 mL對(duì)草菇蛋白酶解效果的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，以酶解時(shí)間（A）、加酶量（B）、底物質(zhì)量濃度（C）為自變量。根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除率 按照試劑盒方法進(jìn)行測定。在離心管中分別加入150 μL 樣品溶液，150 μL 乙醇DPPH 溶液，混勻后在室溫下避光靜置30 min，12000 r/min 室溫離心5 min，使用酶標(biāo)儀于517 nm 處測定吸光度A1。80%甲醇代替乙醇DPPH溶液測得吸光度為A2，80%甲醇代替樣品測得吸光度為A0按照如下公式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

1.2.7.2 Fe2+螯合能力 參考馬夢嬌[20]的方法測定樣品的Fe2+螯合率。在1 mL 樣品溶液中加入雙蒸水3.7 mL、2 mmol/L 的FeCl2溶液0.1 mL 和5 mmol/L菲咯嗪0.2 mL，25 ℃下反應(yīng)10 min，在562 nm 處測定吸光度A1。雙蒸水代替樣品測得吸光度為A0，雙蒸水代替菲咯嗪測得吸光度為A2。按照如下公式計(jì)算Fe2+螯合率。

1.2.7.3 還原力 參考Dong 等[21]的方法略有修改測定樣品的還原能力。將500 μL 樣品添加到500 μL的0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.6）和500 μL 的1%（w/v）鐵氰化鉀的混合液中。將混合物于50 ℃下水浴20 min，然后加入500 μL 的10%（w/v）三氯乙酸，在8000 r/min 下離心10 min。將500 μL 上清液、500 μL 雙蒸水和100 μL 的0.1%（w/v）氯化鐵溶液在室溫下反應(yīng)10 min。在700 nm 處測定溶液的吸光度，吸光度越大說明樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.8 超濾分級(jí) 將響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝條件下制備的酶解液使用10、3 kDa 的超濾離心管進(jìn)行分離純化，得到3 種不同分子量的多肽組分（F1<3 kDa；F2 3～10 kDa；F3>10 kDa），凍干后儲(chǔ)存于?80 ℃，通過體外抗氧化試驗(yàn)評(píng)估其抗氧化活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Origin2019 進(jìn)行繪圖，使用Design-Expert8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

蛋白酶水解蛋白是生產(chǎn)生物活性肽最常用的方法。多肽的抗氧化活性和酶解所用蛋白酶種類有關(guān)，不同蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，可產(chǎn)生具有不同氨基酸和分子量的多肽[22]。因此篩選合適的蛋白酶是制備高活性抗氧化肽的關(guān)鍵步驟。使用4 種不同的單酶和3 種雙酶酶解草菇蛋白，結(jié)果如圖1 所示，相較于草菇蛋白，酶解后產(chǎn)物的抗氧化活性均提高。其中中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率和Fe2+螯合率最大，酶解4 h 后，其DPPH 自由基清除率為61.35%±1.33%，F(xiàn)e2+螯合率為85.98%±0.38%，顯著高于其它蛋白酶酶解產(chǎn)物（P<0.05）。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原力最大為0.36±0.00，其次是中性蛋白酶酶解產(chǎn)物0.35±0.01。中性蛋白酶酶解產(chǎn)物活性最高可能是因?yàn)樗莾?nèi)切酶[23]，主要水解羧基側(cè)含有色氨酸、酪氨酸、丙氨酸等芳香族氨基酸殘基的肽鍵，這些氨基酸的含量與抗氧化活性呈正相關(guān)[24]。綜合考慮，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較高抗氧化活性，因此選擇中性蛋白酶對(duì)抗氧化肽的酶解條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化研究。

圖1 酶種類對(duì)草菇蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of enzyme types on antioxidant activity of V.volvacea protein hydrolysates

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響 酶解時(shí)間對(duì)草菇蛋白酶解產(chǎn)物DPPH 自由基清除率的影響，結(jié)果如圖2 所示。隨著酶解時(shí)間的增加，DPPH自由基清除率呈先增后減趨勢，酶解時(shí)間為4 h 時(shí)，多肽的DPPH 自由基清除率達(dá)到峰值64.19%±1.07%，顯著高于其它處理組（P<0.05）。由于酶解初期，底物含量高，可以充分與酶反應(yīng)，產(chǎn)生具有較高活性的抗氧化肽。隨著時(shí)間的不斷延長，抗氧化肽可能會(huì)進(jìn)一步酶解，從而導(dǎo)致抗氧化活性的降低[25]。因此，酶解時(shí)間對(duì)草菇蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除能力具有重要作用，選取4 h 為最佳酶解時(shí)間進(jìn)行下一步試驗(yàn)。孫菁茹等[26]從綠豆蛋白中制備抗氧化肽，抗氧化活性隨著時(shí)間的增加先增大后減小，其研究結(jié)果與本研究一致。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on DPPH free radical scavenging rate

2.2.2 加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響 由圖3 可知，當(dāng)加酶量為4%時(shí)，DPPH 自由基清除率62.85%±1.20%，達(dá)到最大值,顯著高于其它處理組（P<0.05）。隨著加酶量的增加抗氧化活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是因?yàn)殡S著加酶量的增加，酶與底物反應(yīng)速率增加，但是加酶量過大會(huì)使蛋白質(zhì)過度水解，產(chǎn)生分子量更小的肽段甚至是游離氨基酸，導(dǎo)致具有抗氧化活性的多肽含量降低[27]。因此，選取4%作為最佳加酶量。

圖3 加酶量對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on DPPH free radical scavenging rate

2.2.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響底物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH 自由基清除率的影響如圖4 所示，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為3 g/100 mL 時(shí)，蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值69.33%±0.43%，顯著高于其它處理組（P<0.05）。隨著底物質(zhì)量濃度的增加，DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是由于水在酶解反應(yīng)中有利于其他分子的運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散，底物質(zhì)量濃度小時(shí)，酶與底物無法充分結(jié)合，而底物質(zhì)量濃度過大，蛋白酶與底物接觸不充分，蛋白質(zhì)水解不充分[28]，因此，選取最佳底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL。

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on DPPH free radical scavenging rate

2.3 酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、加酶量、底物質(zhì)量濃度這3 個(gè)因素為自變量，DPPH 自由基清除能力為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Experimental scheme and results of response surface

2.3.2 模型的建立與方差分析 利用軟件Design-Expert11 進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：

回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。模型的顯著水平P<0.0001，表明該回歸模型極顯著；實(shí)驗(yàn)所選模型的決定系數(shù)R2=0.9956，說明響應(yīng)值的變化有99.56%來源于所選的變量，表明模型能有效地反映實(shí)驗(yàn)條件的變化；校正決定系數(shù)RAdj2=0.9899，表明僅有總變異的1.01%不能由該模型來解釋；失擬項(xiàng)P值為0.0720>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，方程擬合度高，可以用該數(shù)學(xué)模型來預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。模型中A、B、C、AC、A2、B2、C2對(duì)DPPH 自由基清除率影響極顯著（P<0.01），由表4 可知，F(xiàn)（A）=197.56，F(xiàn)（B）=29.86，F(xiàn)（C）=14.24，即各因素對(duì)草菇蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>加酶量>底物質(zhì)量濃度。

表4 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 通過軟件Design-Expert 11 分析得到的各因素交互作用的曲線圖和等高線圖見圖5。酶解時(shí)間曲線變化最大，其次是加酶量和底物質(zhì)量濃度。當(dāng)?shù)雀呔€趨于橢圓形時(shí)，表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[29]。響應(yīng)面坡度的陡峭程度也反映出處理?xiàng)l件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響。圖5b 中酶解時(shí)間和底物質(zhì)量濃度的響應(yīng)面彎曲程度最大，則其交互作用最顯著，這一結(jié)果與表4 的方差分析中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用的曲面圖和等高線圖Fig.5 Surface maps and contour maps for each factor interaction

2.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證 采用軟件對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出理論最佳酶解條件為酶解時(shí)間3.713 h、加酶量3.813%、底物質(zhì)量濃度3.106 g/100 mL 時(shí)，此時(shí)的DPPH 自由基清除率最高，其預(yù)測值為70.294%。按照該條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮實(shí)際操作的可行性，選取酶解時(shí)間3.70 h、加酶量3.81%、底物質(zhì)量濃度3.11 g/100 mL，驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)3 次，測定DPPH 自由基清除率為69.85%±2.52%，與理論值相近，證明擬合模型優(yōu)化出的條件較為準(zhǔn)確[30]。

2.4 超濾組分的抗氧化活性

超濾法可根據(jù)分子量大小快速且有效的對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。因此使用3 kDa、10 kDa 的超濾管對(duì)草菇蛋白酶解液進(jìn)行分離，得到3 個(gè)組分。表5 可知，F(xiàn)1（<3 kDa）抗氧化活性顯著高于F2（3～10 kDa）、F3（>10 kDa）和酶解產(chǎn)物（P<0.05)。其DPPH 自由基清除率、Fe2+螯合率和還原力分別為78.81%±1.56%、91.05%±1.65%、0.47±0.02。多肽的抗氧化活性與其分子量大小和氨基酸組成種類及排列順序相關(guān)[31?32]，超濾分離后，分子量較小的多肽抗氧化活性更高，這可能是由于超濾分子量小的多肽具有較小的空間位阻，可以作為更好的電子供體，與自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的產(chǎn)物[33?34]。Yang等[35]從鴨血漿肽超濾所得M1（<3 kDa）的DPPH 自由基清除率、O2?·清除率和ABTS 自由基清除活性分別為68.16%、18.95%和97.59 mmol/L TE/mg，顯著（P<0.05）高于組分M2（3～10 kDa）和M3（>10 kDa），這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，表明分子量低的多肽具有更高的抗氧化活性。

表5 中性蛋白酶酶解產(chǎn)物及其超濾組分的抗氧化活性Table 5 Antioxidant activities of neutral protease hydrolysates and their ultrafiltration components

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以草菇蛋白為原料，通過蛋白酶酶解制備抗氧化肽，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化草菇抗氧化肽的制備工藝。中性蛋白酶酶解草菇蛋白的優(yōu)化條件為：酶解時(shí)間3.70 h、加酶量3.81%、底物質(zhì)量濃度3.11 g/100 mL，此條件下，制備所得抗氧化肽DPPH 自由基清除率為69.85%±2.52%。經(jīng)超濾分離純化所得分子量小于3 kDa 的組分F1 抗氧化活性顯著高于分子量高的組分（P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)為草菇抗氧化肽的制備提供了一定的理論基礎(chǔ)，可通過對(duì)F1 進(jìn)行純化、結(jié)構(gòu)鑒定并探究其可能的作用機(jī)制，進(jìn)一步為草菇蛋白的高值化應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)。