響應(yīng)面法優(yōu)化工業(yè)化獨(dú)立發(fā)酵凝固型發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝

黃 娟 ，黃燕燕，彭小霞

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 511356；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528225）

凝固型發(fā)酵乳區(qū)別于攪拌型發(fā)酵乳，質(zhì)地更脆軟嫩滑，沒有強(qiáng)烈的拉絲狀和糊口感，一直廣受消費(fèi)者的喜愛[1?3]。在凝固型發(fā)酵乳生產(chǎn)中，發(fā)酵劑的發(fā)酵特性（包括發(fā)酵劑的最適發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)）在風(fēng)味形成及質(zhì)構(gòu)方面具有至關(guān)重要的工業(yè)意義，直接影響著發(fā)酵乳的品質(zhì)[4?6]。但實(shí)際生產(chǎn)工藝中，常常受發(fā)酵溫度波動(dòng)（45 ℃的奶經(jīng)過較長(zhǎng)管線灌裝及現(xiàn)場(chǎng)存放，產(chǎn)品最佳發(fā)酵溫度往往將損失5～10 ℃）、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)控制不及時(shí)（現(xiàn)場(chǎng)品控人員的采樣時(shí)機(jī)延誤）、發(fā)酵菌種配比不適宜、接種后灌裝延誤等因素的影響導(dǎo)致發(fā)酵終產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)風(fēng)味不符合預(yù)期。

目前，鮮少有文獻(xiàn)針對(duì)乳品生產(chǎn)工藝中實(shí)際出現(xiàn)的波動(dòng)因素進(jìn)行研究報(bào)道，常見報(bào)道是對(duì)實(shí)驗(yàn)室階段配方或基礎(chǔ)工藝參數(shù)進(jìn)行研究的，例如，陳文璐等[7]優(yōu)化了干酪風(fēng)味發(fā)酵乳的發(fā)酵配方中涉及的白砂糖、穩(wěn)定劑和干酪粉的添加量以及發(fā)酵劑接種量四個(gè)變量因素；蔡達(dá)等[8]優(yōu)化了干酪制作工藝中涉及的發(fā)酵劑添加量、拉伸溫度和拉伸時(shí)間三個(gè)因素；胡盼盼[9]優(yōu)化了副干酪乳桿菌發(fā)酵沙棘酸奶配方涉及的沙棘汁、白砂糖添加量和發(fā)酵劑添加量因素。同樣未見針對(duì)工業(yè)化凝固型發(fā)酵乳生產(chǎn)過程中參數(shù)優(yōu)化的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道，常見的仍然是對(duì)某單一原料或是添加劑或是常規(guī)的基礎(chǔ)工藝條件對(duì)凝固型發(fā)酵乳的理化特性的影響，例如，孫敏等[10]研究了低聚果糖對(duì)低脂凝固型發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，邱爽等[11]研究了細(xì)菌素bifidocin A 對(duì)凝固型發(fā)酵乳品質(zhì)及貯藏性能的影響。

本研究以燕塘乳業(yè)工業(yè)化灌裝的液態(tài)乳基料（未發(fā)酵的獨(dú)立塑料杯裝的凝固型發(fā)酵乳基料）為樣本，針對(duì)生產(chǎn)中實(shí)際出現(xiàn)的凝固型發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)不穩(wěn)定情況以及區(qū)別于實(shí)驗(yàn)室條件的生產(chǎn)不利因素，對(duì)上述發(fā)酵溫度波動(dòng)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)、發(fā)酵菌種配比和灌裝后溫度波動(dòng)及剪切破壞進(jìn)行模擬分析，掌握各個(gè)可控及不可控的單因素對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響程度及通過響應(yīng)面分析法掌握發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)、發(fā)酵菌種配比可控組合因素對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響程度并預(yù)測(cè)最優(yōu)解條件，為工業(yè)化凝固型發(fā)酵乳產(chǎn)品的品質(zhì)穩(wěn)定性控制和工藝優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)，方便生產(chǎn)應(yīng)對(duì)各種突發(fā)狀況及時(shí)作出正確響應(yīng)，減少不必要的成本浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生牛乳 優(yōu)質(zhì)乳工程巴氏殺菌乳，廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司；白砂糖 東方先導(dǎo)（湛江）糖酒有限公司；復(fù)配菌種型號(hào)1（低黏，嗜熱鏈球菌:德氏乳桿菌乳亞種=1:2，活菌數(shù)不低于1.35×1012CFU/g）和型號(hào)2（高黏，嗜熱鏈球菌:保加利亞乳桿菌=1:1，活菌數(shù)不低于6.68×1011CFU/g）、復(fù)合乳化穩(wěn)定劑（明膠、雙乙酰酒石酸單雙甘油酯、果膠） 丹尼斯克（中國）有限公司；低聚果糖 量子高科（廣東）生物有限公司；稀奶油 雀巢（中國）有限公司；乳清蛋白粉戴維林貿(mào)易（廣州）有限公司；氫氧化鈉 AR，廣州化學(xué)試劑廠。

Eppendorf 5427R 離心機(jī) 德國艾本德股份公司；Eppendorf 移液器 德國艾本德股份公司；明澈TM-D 超純水儀器 RephiLe Bioscience Ltd.；FM30-D實(shí)驗(yàn)室高剪切分散乳化機(jī) 上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；APV-1000 均質(zhì)機(jī) SPX Flow Technology；Eco 電位滴定儀 Metrohm；MARS iQ 流變儀HAAKE；DV2T 旋轉(zhuǎn)粘度計(jì) Brookfield。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工業(yè)化獨(dú)立發(fā)酵凝固型發(fā)酵乳的制備 生牛乳經(jīng)80 ℃、15 s 預(yù)巴殺處理冷卻至60 ℃，循環(huán)在線剪切系統(tǒng)加入白砂糖、低聚果糖、稀奶油、乳清蛋白粉、復(fù)合乳化穩(wěn)定劑（明膠、雙乙酰酒石酸單雙甘油酯、果膠）、水，高剪切循環(huán)15 min，再冷卻至10 ℃定容，經(jīng)在線管道過濾網(wǎng)過濾，預(yù)熱至65 ℃經(jīng)脫氣、均質(zhì)處理，95 ℃、300 s 殺菌，冷卻至（42～44）℃，在線無菌操作臺(tái)接種，可能需暫存一定時(shí)間再灌裝（待裝罐到灌裝機(jī)的管線較長(zhǎng)，存在一定的產(chǎn)品溫度損失，灌裝得未發(fā)酵完成的液態(tài)乳基料），推至溫房發(fā)酵至（60～70）°T，入冷庫冷卻，經(jīng)檢驗(yàn)合格后得可出貨的成品。該灌裝工藝受機(jī)器限制區(qū)別于常規(guī)乳企在線升溫?zé)o菌灌裝工藝，同時(shí)也區(qū)別于文獻(xiàn)報(bào)道的一般冷卻至發(fā)酵溫度后接種直接進(jìn)行發(fā)酵的工藝[12?15]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng) 參考文獻(xiàn)[2?3,16]及生產(chǎn)實(shí)際對(duì)發(fā)酵溫度因素進(jìn)行探究，基于1.2.1 所述工藝方法按照復(fù)配菌種型號(hào)1（嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌乳亞種）和型號(hào)2（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）菌種比例（1:1）制備相應(yīng)的工業(yè)化灌裝后但未拉入到溫房發(fā)酵的系列樣品（產(chǎn)品溫度為（36±1）℃），其中，復(fù)配菌種型號(hào)1 較型號(hào)2 在5 h 內(nèi)發(fā)酵前期以△pH 計(jì)產(chǎn)酸速度相對(duì)快的，產(chǎn)黏速度較型號(hào)2 是比較慢的（黏度以使用博勒飛旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)63 號(hào)轉(zhuǎn)子在30 r/min、30 s 相同參數(shù)條件下測(cè)試發(fā)酵同等時(shí)間的發(fā)酵乳樣品得到的絕對(duì)黏度數(shù)據(jù)計(jì)），分別取30 個(gè)樣品置于實(shí)驗(yàn)室提前預(yù)熱至37、40、43 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每個(gè)發(fā)酵溫度條件下，每1～1.5 h 隨機(jī)抽取培養(yǎng)箱3 個(gè)位置的發(fā)酵乳產(chǎn)品進(jìn)行酸度滴定，當(dāng)酸度達(dá)到（65±2）°T 時(shí)，取出對(duì)應(yīng)產(chǎn)品置于4 ℃冰箱冷藏12 h 后進(jìn)行成品感官評(píng)價(jià)。

參考文獻(xiàn)[3?4,17]及生產(chǎn)實(shí)際對(duì)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)因素進(jìn)行探究，另外，將復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 菌種比例（1:1）且工業(yè)化在線已升溫至40 ℃灌裝至塑料杯中的液態(tài)奶置于42 ℃電熱培養(yǎng)箱中，分別發(fā)酵4.5、5.5 和6.5 h 不同時(shí)間，再置于4 ℃冰箱冷藏后熟化12 h 后進(jìn)行綜合感官評(píng)價(jià)。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度波動(dòng) 生產(chǎn)實(shí)際中存在灌裝外段推入溫房延誤導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)不良的情況，故將該因素納入本研究范圍并進(jìn)行了模擬。將復(fù)配菌種型號(hào)1和型號(hào)2 菌種比例（1:1）且工業(yè)化在線已升溫至40 ℃灌裝至塑料杯中的液態(tài)奶置于42 ℃水浴保溫5 min 后再分別進(jìn)行如表1 所示的溫度控制，例如，第一組置于10 ℃下保持1 h，然后直接置于42 ℃保持6 h，其他組依次按表格進(jìn)行從左至右的溫度波動(dòng)模擬實(shí)驗(yàn)，然后統(tǒng)計(jì)發(fā)酵終點(diǎn)酸度和過夜發(fā)酵酸度以及產(chǎn)品的不良率。

表1 工業(yè)化獨(dú)立發(fā)酵凝固型發(fā)酵乳的溫度波動(dòng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of temperature fluctuation of industrialized independent fermentation coagulated fermented milk

1.2.2.3 發(fā)酵過程剪切破壞 生產(chǎn)實(shí)際中存在灌裝延誤（待裝罐中的液態(tài)乳輕度發(fā)酵）導(dǎo)致輕發(fā)酵產(chǎn)品被剪切后再發(fā)酵凝固成型后產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)不良的情況，故將該因素納入了本研究范圍并進(jìn)行模擬。42 ℃且復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 菌種比例（1:1）發(fā)酵條件下，以手動(dòng)上下劇烈搖晃灌裝樣品10 下（以完成一次上和下的運(yùn)動(dòng)合計(jì)為1 次，搖晃幅度上下不超過20 cm）來模擬工業(yè)化灌裝后破壞，搖晃頻次為1 次/h，分別搖晃0、1、2、3、4 次，并監(jiān)控產(chǎn)品過程狀態(tài)好熱滴定發(fā)酵過程的產(chǎn)品酸度，同時(shí)對(duì)發(fā)酵酸度達(dá)到要求的產(chǎn)品冷藏后熟化12 h 后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.2.4 菌種比例 參考文獻(xiàn)[12,18?19]及生產(chǎn)實(shí)際對(duì)發(fā)酵菌種比例因素進(jìn)行探究，發(fā)酵菌種配比探究實(shí)驗(yàn)在小型實(shí)驗(yàn)室模擬完成，菌種接種總量為200 DCU/T（2×1013CFU/T），復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 菌種比例分別為：1:0、1:1、0:1 DCU/DCU，發(fā)酵溫度為42 ℃，使用酸化監(jiān)控儀記錄產(chǎn)品的發(fā)酵過程酸化曲線，分別采樣監(jiān)控產(chǎn)品過程狀態(tài)并滴定發(fā)酵過程的產(chǎn)品酸度，同時(shí)對(duì)發(fā)酵酸度達(dá)到要求的產(chǎn)品冷藏后熟化12 h 后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[14?15]。

1.2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)1.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照文獻(xiàn)方法[20?22]，按表2 進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面法Box-Behnken 設(shè)計(jì)（BBD）組合試驗(yàn)，包含了20 組，所得數(shù)據(jù)通過式（1）進(jìn)行曲面擬合。

表2 工業(yè)化獨(dú)立發(fā)酵凝固型發(fā)酵乳發(fā)酵工藝的BBD因素水平設(shè)計(jì)Table 2 BBD factor level design of industrialized independent fermentation coagulated fermented milk fermentation process

其中，Y 為響應(yīng)值，k0～k9均為多項(xiàng)式系數(shù)，在實(shí)際響應(yīng)面和等值線圖基礎(chǔ)上回歸分析確立，A、B、C 為獨(dú)立變量的水平編碼值。

1.2.4 酸度、pH 測(cè)定 使用萬通Eco 電位滴定儀完成對(duì)發(fā)酵乳的酸度滴定，以pH8.3 判定滴定終點(diǎn)，以吉爾涅爾度（°T）表示，即每100 mL 樣品消耗0.1 mol/L NaOH 溶液的毫升數(shù)。同時(shí)測(cè)定pH。

1.2.5 凝固型發(fā)酵乳感官評(píng)分設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[17,23?24]感官評(píng)價(jià)方法同時(shí)結(jié)合本研究產(chǎn)品實(shí)際情況設(shè)計(jì)了表3 凝固型發(fā)酵乳產(chǎn)品的發(fā)酵過程及發(fā)酵冷藏后熟化12 h 后的質(zhì)構(gòu)風(fēng)味等感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以終產(chǎn)品的綜合權(quán)重得分作為產(chǎn)品的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。受過專業(yè)訓(xùn)練的感官評(píng)價(jià)員20 人，統(tǒng)計(jì)20 人的平均評(píng)分，且不良率以表3 中鏡面光滑度5 分以下或冷藏后熟化狀態(tài)5 分以下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表3 凝固型發(fā)酵乳產(chǎn)品的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory scoring standard for coagulated fermented milk products

式中：xi為每一個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目的對(duì)應(yīng)得分，wi為每一個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目的對(duì)應(yīng)計(jì)分權(quán)重。

1.2.6 最優(yōu)條件下的發(fā)酵乳特性分析 依據(jù)1.2.5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制備相應(yīng)的發(fā)酵乳，并對(duì)該發(fā)酵乳的發(fā)酵酸化過程、感官特性及流變學(xué)特性進(jìn)行分析，其中流變學(xué)特性參考文獻(xiàn)[25?28]采取三段式剪切掃描模式，觀察200 s?1高頻率剪切破壞后產(chǎn)品黏度和應(yīng)力恢復(fù)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)分析所用數(shù)據(jù)是三組平行實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 17.0 進(jìn)行平行數(shù)據(jù)及組間數(shù)據(jù)的顯著性分析，并利用Origin Pro 2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的影響 如圖1 所示，結(jié)果表明在適宜發(fā)酵的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，酸化速度越快，43 ℃發(fā)酵溫度條件下的酸化速度最快，但表4 結(jié)果表明該溫度條件下的產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味卻不如40 ℃的?？赡茉蚴前l(fā)酵劑中的乳酸菌不同溫度條件下代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)（包括乳酸等酸類物質(zhì)）種類和含量不同，導(dǎo)致pH 降低速度不同，酪蛋白膠束通過等電沉淀的聚合度不同，間接影響風(fēng)味的釋放和保水性（以感官評(píng)價(jià)中表面乳清析出量作評(píng)判）等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，因此，本研究中的發(fā)酵劑在43 ℃較高溫度條件下，可能代謝產(chǎn)刺激性酸味物質(zhì)的速度較快，產(chǎn)特征性風(fēng)味物質(zhì)醛、醇或酯類不足，同時(shí)酸化速度較快，導(dǎo)致酪蛋白膠束提前聚合，在后發(fā)酵及冷藏過程中因酪蛋白膠束被打斷，聚合度下降，從而使脫水收縮率增加[10,18?19]。因此，38～42℃范圍內(nèi)的發(fā)酵溫度是本研究需要繼續(xù)優(yōu)化的關(guān)鍵因素。

圖1 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵酸度、pH 的影響Fig.1 The influence of fermentation temperature and fermentation time on fermentation acidity and pH

42 ℃分別發(fā)酵4.5、5.5 和6.5 h 的綜合感官評(píng)分情況如表4 所示，結(jié)果表明，其綜合感官評(píng)分從高到低依次為：發(fā)酵5.5、6.5 和4.5 h。發(fā)酵時(shí)間越短，酸奶質(zhì)構(gòu)越脆嫩，但保水性差，發(fā)酵風(fēng)味弱；發(fā)酵時(shí)間越久，發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)越結(jié)實(shí)，發(fā)酵風(fēng)味更突出，但不夠脆嫩，可能是由于發(fā)酵后期復(fù)配菌種產(chǎn)生了更多的風(fēng)味物質(zhì)和黏性多糖，而酸奶中的黏性多糖和蛋白形成的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)則越緊密越穩(wěn)定，表現(xiàn)出來的質(zhì)構(gòu)則越結(jié)實(shí)[29?32]。孫敏等[10]研究也發(fā)現(xiàn)添加低聚果糖可以提高低脂凝固型發(fā)酵乳的硬度，有利于凝固型酸奶發(fā)酵過程中的成型，推測(cè)可能是由于低聚果糖的添加會(huì)改變低脂凝聚發(fā)酵乳的酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)，彼此之間或者和水分子間可以連接在一起，形成重排的酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)。因此4～6 h 范圍內(nèi)的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)是本研究需要繼續(xù)優(yōu)化的關(guān)鍵因素。

表4 不同條件下制備的工業(yè)化獨(dú)立發(fā)酵凝固型發(fā)酵乳的感官評(píng)分及不同搖晃次數(shù)發(fā)酵7 h 的產(chǎn)品酸度Table 4 Sensory scores of industrialized independent fermentation coagulated fermented milk prepared under different conditions and acidity of products fermented for 7 hours with different shaking times

2.1.2 發(fā)酵溫度波動(dòng)的影響 如表5 所示，與第6 組無溫度波動(dòng)組別相比，第1 組和第3 組的酸化速度受到顯著影響（P<0.05），產(chǎn)品的不良率均顯著高于第6 組對(duì)照組（P<0.05），該結(jié)果表明產(chǎn)品發(fā)酵溫度波動(dòng)將顯著影響產(chǎn)品酸化速度和產(chǎn)品的不良率。分析原因可能是由于溫度的波動(dòng)影響到了菌種的生長(zhǎng)及代謝活力，在非最適宜溫度條件下，部分乳酸菌可能處于休眠、生長(zhǎng)停滯狀態(tài)甚至是衰亡等不良狀態(tài)，還有部分乳酸菌、低溫非發(fā)酵菌處于弱發(fā)酵狀態(tài)，待恢復(fù)到最適宜發(fā)酵的溫度條件時(shí)，總的菌活力明顯下降，發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)生變化，導(dǎo)致酸奶質(zhì)地和風(fēng)味發(fā)生變化[12,18?19]。其中，第1 組的產(chǎn)品不良率相對(duì)其他組低，可能是因?yàn)?0 ℃條件下弱發(fā)酵極其微弱，無長(zhǎng)時(shí)間中溫（25～30 ℃）的環(huán)境溫度過渡，則更利于菌種的復(fù)蘇和正常發(fā)酵，但從10 ℃緩慢升溫至42 ℃的發(fā)酵過程仍然會(huì)對(duì)酸奶的凝固狀態(tài)造成影響。因此，冷灌裝再推入溫房發(fā)酵也無法有效降低產(chǎn)品的不良率，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，只能縮短灌裝后尾端常溫環(huán)境中的存放時(shí)間，實(shí)際溫度監(jiān)測(cè)驗(yàn)證顯示，尾段存放不超過20 min 推入溫房時(shí)，產(chǎn)品溫度可以保持在36 ℃以上，該措施可有效降低發(fā)酵溫度波動(dòng)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)的影響。

表5 發(fā)酵溫度波動(dòng)對(duì)產(chǎn)品不良率及酸化速度的影響Table 5 The influence of fermentation temperature fluctuation on product defect rate and acidification speed

2.1.3 發(fā)酵過程剪切破壞的影響 如表4 所示，在2 h 內(nèi)發(fā)生凝乳現(xiàn)象前進(jìn)行剪切搖晃破壞，對(duì)產(chǎn)品的發(fā)酵酸化速度影響不明顯，但第3 和4 h 輕度凝乳現(xiàn)象發(fā)生后繼續(xù)剪切搖晃破壞，將顯著影響產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)（P<0.01）、香氣（P<0.01）、味道（P<0.05）以及酸化速度（P<0.01）。可能是由于在2 h 內(nèi)pH 下降幅度不大，酪蛋白膠束也未開始聚合，此時(shí)剪切搖晃破壞對(duì)發(fā)酵體系影響較微弱，而2 h 后，酪蛋白膠束開始緩慢形成，剪切搖晃將對(duì)膠束結(jié)構(gòu)形成不可逆的破壞作用，再次形成的酪蛋白膠束的聚合度發(fā)生變化，保水性發(fā)生變化，因此，工業(yè)化在線升溫后，若因生產(chǎn)故障等因素2 h 內(nèi)未及時(shí)完成灌裝，建議繼續(xù)發(fā)酵為成品酸奶再進(jìn)行配料使用，超出2 h 的灌裝尾段產(chǎn)品也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行舍棄，否則易引起產(chǎn)品品質(zhì)投訴或是產(chǎn)品報(bào)廢。

2.1.4 菌種比例的影響 如圖2 所示，復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 菌種比例為（1:1）的酸化速度最快，且表4 結(jié)果顯示產(chǎn)品發(fā)酵質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味水平整體最佳。該結(jié)果表明單一型號(hào)的復(fù)配菌種發(fā)酵風(fēng)味比聯(lián)合型號(hào)差，因此優(yōu)先選擇使用聯(lián)合型號(hào)的菌種組別，其中，菌種比例1:1 的綜合感官評(píng)分為8.50 處于較高水平，故可在此菌種比例基礎(chǔ)上作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 菌種比例對(duì)產(chǎn)品酸化速度的影響Fig.2 The influence of strain ratio on the acidification speed of products

2.2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分的影響

依據(jù)BBD 模型，評(píng)判發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)及菌種比例三因素對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分的影響程度，結(jié)果如表6 所示。多重回歸分析揭示了產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分與實(shí)驗(yàn)變量之間的關(guān)系，可通過如下的表達(dá)式進(jìn)行描述：

表6 基于Box-Behnken 設(shè)計(jì)的不同因素水平組合下的凝固型發(fā)酵乳的綜合感官得分Table 6 Comprehensive sensory evaluation of coagulated fermented milk under different factor level combinations based on Box-Behnken design

式中，A、B、C 分別取發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)（B）及菌種比例（C）的編碼值。

各因素間交互作用對(duì)凝固型發(fā)酵乳感官評(píng)分影響的響應(yīng)面模型的方差分析結(jié)果如表7 所示，P<0.0001，差異極顯著，該模型缺少的擬合值的顯著性為0.1288（P>0.05），失擬項(xiàng)不顯著，這說明缺乏的擬合值并不重要。該模型對(duì)應(yīng)的R2為0.9916，接近于1，表明此模型與真實(shí)數(shù)據(jù)之間具有良好的適用性。由F檢驗(yàn)可知影響發(fā)酵乳感官品質(zhì)的主次因素為菌種比例>發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)>發(fā)酵溫度，綜上可知，該回歸模型較好地定義了該系統(tǒng)中各因素與綜合感官得分之間的關(guān)系及任意兩個(gè)變量之間的相互聯(lián)系。圖3 為三維響應(yīng)曲面和等高線圖，如圖3A 所示，當(dāng)菌種比例處于0 這個(gè)中間層次時(shí)，觀察發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)之間形成的等高線圖，偏離橢圓形狀，表明二者的交互作用對(duì)產(chǎn)品的綜合感官評(píng)分沒有顯著性的影響（P>0.05），同樣的現(xiàn)象可在圖3B、圖3C 中觀察到，這表明發(fā)酵溫度和菌種比例、菌種比例和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的交互作用對(duì)產(chǎn)品的綜合感官評(píng)分也沒有顯著的影響（P>0.05），與表7 中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 各因素間交互作用對(duì)凝固型發(fā)酵乳感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.3 Response surface and contour lines of the interaction of various factors on the sensory score of coagulated fermented milk

表7 基于Box-Behnken 設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面二次模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for quadratic model of response surface based on Box-Behnken design

利用Design Expert 軟件計(jì)算出工業(yè)化獨(dú)立發(fā)酵凝固型發(fā)酵乳的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度42 ℃，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)5.572 h，復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 菌種配比0.939，此時(shí)感官得分預(yù)測(cè)值最高為8.288 分。

2.3 最優(yōu)條件下的凝固型發(fā)酵乳的特性

在實(shí)際發(fā)酵溫度42 ℃，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)5.6 h，復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 的菌種配比1:1 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)應(yīng)該條件下的發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)完好率（以酸奶鏡面光滑度和冷藏后熟化狀態(tài)評(píng)分均8 分以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）為100%，發(fā)酵乳的綜合感官評(píng)分為（8.24±0.35）分，與2.1.4 菌種比例1:1 的工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵乳樣品8.50 分的感官評(píng)分接近，同時(shí)也與8.288 分預(yù)測(cè)值接近，證明模型有效，其中，工業(yè)化的感官評(píng)分更高的原因可能是工業(yè)化剪切乳化效果更佳，其酸化曲線如圖4 所示，發(fā)酵5.6 h時(shí)的終點(diǎn)酸度為68.56°T，出冷柜時(shí)為70.2°T，可滿足國標(biāo)70°T 的要求。流變學(xué)特性曲線如圖5，結(jié)果顯示該發(fā)酵乳的抗剪切能力較弱，初始黏度最大為2005000 mPa·s，經(jīng)過高速剪切后的黏度最高可以恢復(fù)至512300 mPa·s，恢復(fù)率為25.55%，符合脆軟嫩滑形式的凝固型發(fā)酵乳的感官特點(diǎn)。工業(yè)化生產(chǎn)條件下也完成了3 批次的驗(yàn)證，結(jié)果表明，灌裝尾段常溫環(huán)境中暫存20 min 以內(nèi)隨機(jī)抽取的30 個(gè)樣品的產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)完好率也為100%，感官風(fēng)味結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室一致。

圖4 最優(yōu)條件下凝固型發(fā)酵乳的酸化曲線Fig.4 Acidification curve of coagulated fermented milk under optimal condition

圖5 最優(yōu)條件下凝固型發(fā)酵乳的流變學(xué)三段式剪切掃描曲線Fig.5 Rheological three-section shear scan curve of coagulated fermented milk under optimal condition

3 結(jié)論

本研究基于前人實(shí)驗(yàn)室階段的凝固型發(fā)酵乳的探索研究，密切結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際影響因素對(duì)工業(yè)化發(fā)酵乳產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化處理，確立了最佳工藝條件：在接種發(fā)酵2 h 內(nèi)完成灌裝、外段暫存不超過20 min、發(fā)酵溫度42 ℃，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)5.6 h、復(fù)配菌種型號(hào)1 和型號(hào)2 的菌種配比1:1。最優(yōu)條件下的發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)完好率（以酸奶鏡面光滑度和冷藏后熟化狀態(tài)評(píng)分均8 分以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）為100%，發(fā)酵乳的綜合感官得分為（8.24±0.35）分，發(fā)酵5.6 h 時(shí)的終點(diǎn)酸度為68.56°T，出冷柜時(shí)為70.2°T，可滿足國標(biāo)70°T 要求。產(chǎn)品初始黏度最大為2005000 mPa·s，經(jīng)過高速剪切后的黏度最高可以恢復(fù)至512300 mPa·s，恢復(fù)率為25.55%，符合脆軟嫩滑形式的凝固型發(fā)酵乳的感官特點(diǎn)。其中，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示灌裝后發(fā)酵2 h 內(nèi)剪切破壞影響不大，但超出時(shí)間后將嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)和酸化速度，灌裝后發(fā)酵溫度波動(dòng)將顯著影響產(chǎn)品酸化速度和產(chǎn)品的不良率，提示工業(yè)化發(fā)酵過程中應(yīng)當(dāng)盡量縮短灌裝后段液態(tài)乳在常溫環(huán)境中的暫存時(shí)間。響應(yīng)面法優(yōu)化分析發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)和菌種比例三可控顯著性影響因素，結(jié)果提示該方法可有效擬合三者之間的關(guān)系，可以為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)方法和依據(jù)，可以拓展該方法在乳品實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。為工業(yè)化生產(chǎn)中不可避免出現(xiàn)的菌種配比稱量誤差、發(fā)酵溫度堆熱傳熱波動(dòng)、人為取樣時(shí)機(jī)導(dǎo)致的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)誤差等情況給予了一定的理論指導(dǎo)，方便在實(shí)際操作中，快速反應(yīng)作出相應(yīng)的對(duì)策。另外，200 s?1高剪切后的酸奶黏度恢復(fù)率僅為25.55%，符合脆軟嫩滑形式的凝固型發(fā)酵乳的感官特點(diǎn)，未來可結(jié)合流變儀對(duì)凝固型發(fā)酵乳進(jìn)行品質(zhì)控制或是抗運(yùn)輸特性進(jìn)行深入研究。