屎腸球菌與釀酒酵母共發(fā)酵產γ-氨基丁酸條件優(yōu)化及機制研究

孫向陽，汪 杰，姚紅梅，鄭淼心，李嬋媛，張恕銘，張 慶

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都 610039）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳氨基酸，廣泛存在于生物體內，由L-谷氨酸經谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）脫羧合成[1]，具有降壓[2]、抗抑郁[3]、預防糖尿病[4]、緩解疼痛[5]等功能。隨著年齡增長，人體內的GABA 合成能力不斷減弱，會出現失眠、焦躁、疲乏等癥狀，因此日常進食含GABA 的食藥品是補充該功能物質的一種有效方式[6]。然而，動植物體內的GABA 含量低，難以大量提取分離，尋求高效合成GABA 的途徑受到越來越多研究者的關注[7]。微生物發(fā)酵合成GABA不受時間、空間、能源的限制，且兼有低成本、高產量等顯著特點，成為當前生產食藥級GABA 較為理想的途徑[8]。目前微生物產GABA 的研究大多使用單一乳酸菌發(fā)酵[9?12]，而以乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵產GABA 的研究鮮有報道。

對于底物成分復雜的發(fā)酵體系，單一純種發(fā)酵具有明顯的應用局限，優(yōu)勢互補的多菌株協同發(fā)酵為解決該局限性提供了新的思路[13]。特別是乳酸菌酵母菌之間的良性互動，為解決單一純種發(fā)酵某些底物難以代謝的問題營造了良好的代謝環(huán)境。有研究表明，共生乳酸菌酵母菌的互作可基于營養(yǎng)物質交換，從而促進菌株的生長代謝以提高目標化合物的產量[14]；乳酸菌難以代謝蛋白質，引入蛋白質代謝能力較強的酵母菌產生的各種氨基酸則可以被乳酸菌良好利用，且酵母菌也可產生維生素和肽類等營養(yǎng)因子[15]；乳酸菌也可利用酵母菌難以代謝的蘋果酸等物質，產生丙酸、丁酸，作為酵母菌合成風味物質的前體[16]?；谝陨涎芯?，篩選具有共生作用的乳酸菌和酵母菌并采用共發(fā)酵的方式提高GABA 產量是可行的。

屎腸球菌為常見的腸道益生乳酸菌，可改善哺乳動物體內的腸道環(huán)境，增強免疫能力，對哺乳動物的生長及腸道菌群的穩(wěn)定具有重要的意義[17]。釀酒酵母為具有潛在益生特性的菌株，廣泛應用于食品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)[18]。通過合理構建屎腸球菌和釀酒酵母的共發(fā)酵條件從而提高GABA 產量，以及研究其高產GABA 機理具有重要的意義。因此，本研究以前期篩選的產GABA 的屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 為發(fā)酵菌株，研究采用共發(fā)酵提高GABA 產量，通過響應面分析法優(yōu)化共發(fā)酵的發(fā)酵條件，且分析GAD 酶活及互作模式，旨在為具有共生作用的乳酸菌和酵母菌高產GABA 及機理探討提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗室篩選鑒定的產GABA 的屎腸球菌AB157[19]（Enterococcus faeciumAB157，NCBI 登錄號MH578625）和釀酒酵母SC-125（Saccharomyces cerevisiaeSC-125，NCBI 登錄號為MW279237） 西華大學古法發(fā)酵（釀造）生物技術研究所保藏；GABA

色譜純（含量≥98%），上海金穗生物科技有限公司；丹磺酰氯 色譜純（含量≥98%），成都華夏化學試劑有限公司；L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG） 分析純（含量≥98.5%），成都科龍化工試劑廠；MRS 肉湯、MRS 選擇性瓊脂、YPD 液體培養(yǎng)基和PDA 選擇性瓊脂參照文獻[20]配制，根據需要添加不同質量濃度的L-MSG。

FA1104 電子天平 上海舜宇恒平有限公司；pHS-3C pH計成都方舟科技公司；Allerga X-15R 冷凍離心機 美國賽默飛公司；JY98-IIIDN 超聲細胞破碎機 寧波新芝生物科技有限公司；GM-0.33AL 隔膜真空泵 天津津騰實驗設備有限公司；Waters2695高效液相色譜 美國Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 共發(fā)酵的單因素實驗 選擇培養(yǎng)至對數生長期的屎腸球菌AB157（8.79 lg （CFU/mL））和釀酒酵母SC-125（7.81 lg （CFU/mL））作為種子。根據查閱文獻及前期試驗篩選[21?22]，以MRS 肉湯為基礎培養(yǎng)基。在總接種量為2%（V/V），分別考察在接種比例為1:1（V/V），L-谷氨酸鈉添加量為12 g/L，靜置發(fā)酵96 h 時，不同發(fā)酵溫度（30、32、35、38、40 ℃）；在發(fā)酵溫度為35 ℃，L-谷氨酸鈉添加量為12 g/L，靜置發(fā)酵96 h 時，不同屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 接種比例（1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、1:0、0:1（V/V））；在發(fā)酵溫度為35 ℃，接種比例為4:1（V/V），靜置發(fā)酵96 h 時，不同L-谷氨酸鈉質量濃度（0、4、8、12、16、20 g/L）；及在發(fā)酵溫度為35 ℃，接種比例為4:1（V/V）和L-谷氨酸鈉添加量為12 g/L 時，不同發(fā)酵時間（0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h）對屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 共發(fā)酵時GABA 產量和活菌數的影響。

1.2.2 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，以發(fā)酵溫度、接種比例和L-谷氨酸鈉質量濃度為考察因素，選取相應的響應面設計中心點，以GABA 產量為響應值，對試驗數據進行優(yōu)化試驗。因素水平見表1。

1.2.3 GABA 含量測定 GABA 參照Zhang 等[23]利用丹磺酰氯衍生的方法，采用HPLC 分析。HPLC檢測條件：色譜柱為ODS-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣10 μL；水系為四氫呋喃-甲醇-乙酸鈉溶液（4.1 g/L，乙酸調pH 至6.2）=1:15:84（V/V/V），有機系為甲醇；1 mL/min梯度洗脫，水系比例為：80%保持6 min，14 min 降至50%，1 min 降至0%，0%保持5 min，1 min 升至80%，80%保持3 min，總洗脫時間30 min。

1.2.4 選擇性培養(yǎng)基法測定活菌數 待測菌液適當稀釋，涂布計數。其中共發(fā)酵同時用MRS 選擇性瓊脂和PDA 選擇性瓊脂計數，屎腸球菌單菌發(fā)酵用MRS 選擇性瓊脂計數，釀酒酵母單菌發(fā)酵用PDA選擇性瓊脂計數。

1.2.5 GAD 酶活力測定

1.2.5.1 GAD 粗酶液制備 參照彭春龍等[24]的試驗方法，略有修改，收集最優(yōu)條件下不同發(fā)酵時期及不同發(fā)酵體系的菌體，10000 r/min，4 ℃離心10 min，PBS 洗滌2 次，保留菌體；加入等體積含2.47 mg/mL磷酸吡哆醛，0.2 mg/mL 溶菌酶的0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH7.2）懸浮菌體，37 ℃振蕩1 h，冰浴細胞破碎，功率400 W，運行時間5 s，間歇時間5 s，循環(huán)180 次。破碎液4 ℃、10000 r/min 離心10 min，去除沉淀，即為GAD 粗酶液。

1.2.5.2 GAD 酶活力測定 取GAD 粗酶液400 μL，與等體積底物溶液（0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液，pH4.4，含12 g/L L-MSG，2.47 mg/mL 磷酸吡哆醛）混合，37 ℃溫浴30 min，置于沸水浴中10 min，離心收集上清液，采用HPLC 測定生成的GABA，HPLC 條件同1.2.3。酶活（U）定義：在試驗條件下，1000 μL 粗酶液1 min 產生1 μmol GABA 的酶量。

1.2.6 無細胞上清液對菌株發(fā)酵產GABA 的影響收集培養(yǎng)至12 h 的屎腸球菌AB157 單菌發(fā)酵液、釀酒酵母SC-125 單菌發(fā)酵液及屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 共發(fā)酵液，調pH 與MRS 肉湯pH 相等，將發(fā)酵液在8000 r/min 轉速下離心10 min，取上清液，過0.22 μm 有機濾膜，收集上清液即為無細胞上清液（cell-free supernatant，CFS）。

將制備的屎腸球菌AB157 CFS、釀酒酵母SC-125 CFS 和共發(fā)酵CFS 分別按培養(yǎng)基總體積分數20%的量加入到MRS 肉湯（L-MSG 終濃度為12 g/L）中，等體積的MRS 肉湯作對照[14]。分別接入釀酒酵母SC-125（2%，V/V）和屎腸球菌AB157（2%，V/V）進行單一菌株發(fā)酵，35 ℃發(fā)酵96 h，測定GABA 產量。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 20.0 進行顯著性分析，柱狀圖折線圖采用Origin 8.5 進行繪制，響應面采用Design Expert 8.0.6 分析。每組試驗三個平行，所有結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 共發(fā)酵單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對共發(fā)酵產GABA 和活菌數的影響

發(fā)酵溫度對GABA 產量（圖1A）和活菌數（圖1B）影響結果如圖1 所示。隨溫度升高，共發(fā)酵及屎腸球菌AB157 單菌發(fā)酵中的GABA 濃度表現為先顯著增加后逐漸降低，在35 ℃達到GABA 產量最大值，GABA 最高產量為共發(fā)酵4.81 g/L，屎腸球菌AB157單菌發(fā)酵為3.66 g/L，釀酒酵母SC-125 單菌發(fā)酵為0.14 g/L。分析發(fā)酵體系的活菌數（圖1B）可知，屎腸球菌AB157 在共發(fā)酵和單菌發(fā)酵中，其活菌數隨溫度的改變變化不大，當發(fā)酵溫度高于35 ℃時，其活菌數開始下降；釀酒酵母SC-125 的活菌數隨著發(fā)酵溫度的升高逐漸降低，溫度升高其生長被顯著抑制。發(fā)酵溫度可影響微生物的代謝以及胞內催化L-MSG生成GABA 的酶GAD 的酶活力，適宜的發(fā)酵溫度有助于提高GABA 的產量[25?26]。因此，確定共發(fā)酵的溫度為35 ℃。

圖1 發(fā)酵溫度對GABA 產量及活菌數的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on GABA yield and viable cell counts

2.1.2 接種比例對共發(fā)酵產GABA 和活菌數的影響不同接種比例對GABA 產量（圖2A）和活菌數（圖2B）影響結果如圖2 所示。由圖2A 可知，當屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 的接種比例為4:1 時，GABA 產量最高，達6.44 g/L。由圖2B 可知，不同接種比例對屎腸球菌AB157 的活菌數影響不大；而隨著接種比例的增加，釀酒酵母SC-125 的活菌數呈下降趨勢。有研究表明，釀酒酵母可分泌營養(yǎng)因子促進乳酸菌的代謝，且消耗氧氣和產生CO2為乳酸菌提供良好的生長環(huán)境[27?29]。適宜的接種比例可為共發(fā)酵體系中微生物的生長及GABA 的轉化合成提供良好的環(huán)境。因此，確定最適接種比例為4:1。

圖2 接種比例對GABA 產量和活菌數的影響Fig.2 Effect of inoculum proportions on GABA yield and viable cell counts

2.1.3 底物濃度對共發(fā)酵產GABA 和活菌數的影響不同L-谷氨酸鈉質量濃度對GABA 產量（圖3A）和活菌數（圖3B）影響結果如圖3 所示。由圖3A 可知，各發(fā)酵體系中的GABA 產量隨著L-谷氨酸鈉濃度的增加表現為先顯著增加后逐漸降低，添加L-谷氨酸鈉12 g/L 時，共發(fā)酵GABA 產量達到最大6.56 g/L，此時屎腸球菌和釀酒酵母單菌發(fā)酵GABA產量分別為3.67 g/L 和0.13 g/L。由圖3B 可知，不同L-谷氨酸鈉濃度對屎腸球菌AB157 的活菌數基本無影響，而在共發(fā)酵體系中，隨著底物濃度增加，釀酒酵母SC-125 的活菌數呈現先增加后降低的趨勢。Komatsuzaki 等[30]研究表明，適量的增加L-谷氨酸鈉有利于微生物的生長和產物GABA 的生成，但L-谷氨酸鈉濃度過高，發(fā)酵體系的滲透壓增大，微生物的代謝會受到抑制，GABA 的產量反而降低。因此，確定最適的L-谷氨酸鈉質量濃度為12 g/L。

圖3 底物濃度對GABA 產量及活菌數的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on GABA yield and viable cell counts

2.1.4 發(fā)酵時間對共發(fā)酵產GABA 和活菌數的影響不同發(fā)酵時間對GABA 產量（圖4A）和活菌數（圖4B）影響結果如圖4 所示。由圖4A 可知，各發(fā)酵體系中的GABA 產量隨著發(fā)酵時間的延長而顯著增加，在96 h 時，共發(fā)酵GABA 產量達到最大6.57g/L，且高于單菌發(fā)酵，隨后趨于穩(wěn)定。由圖4B可知，屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 的活菌數隨著發(fā)酵的進行其變化趨勢基本一致，且在達到對數生長期后趨于穩(wěn)定。因此，確定最適宜的發(fā)酵時間為96 h。

圖4 發(fā)酵時間對GABA 產量及活菌數的影響Fig.4 Effect of fermentation time on GABA yield and viable cell counts

2.2 響應面試驗優(yōu)化結果

采用Box-Behnken 響應面設計結合單因素試驗結果，以發(fā)酵溫度（A）、接種比例（B）和L-谷氨酸鈉質量濃度（C）為自變量，GABA 產量為響應值。以發(fā)酵溫度35 ℃、接種比例4:1 和底物濃度12 g/L 為分析中心點（如表2），進行響應面試驗。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results

對試驗數據進行擬合分析，得到以GABA 產量（Y）的回歸方程：

根據回歸模型方差分析（表3）可知，該模型極顯著，即P<0.0001，F=178.69，且失擬項P>0.05 不顯著，表明該模型可用于發(fā)酵預測。此外，R2=0.9957，可以解釋99.57%的響應值變化，校正后R2Adj=0.9901與R2接近，表明模型擬合度較好。以上結果表明該模型擬合度較好，可用于試驗預測。同時，發(fā)酵溫度（A）、接種比例（B）、L-谷氨酸鈉質量濃度（C）和A2、B2及C2的P值小于0.01，表明對GABA 的產量影響極顯著；交互項中，AC 達到極顯著水平（P<0.01），表明發(fā)酵溫度和L-谷氨酸鈉質量濃度的交互作用對GABA 的生成影響最為顯著。由F值可知，影響GABA 產量的因素依次為L-谷氨酸鈉質量濃度>接種比例>發(fā)酵溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

對該回歸方程分析，得到最優(yōu)的共發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度35.26 ℃、屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 的接種比例4.92:1（V/V）、底物濃度12.24 g/L，該條件下預測GABA 產量為6.67 g/L。

為驗證預測的可靠性，結合最優(yōu)值和實際應用確定共發(fā)酵因素值為：發(fā)酵溫度35 ℃、接種比例為5:1（V/V）、底物濃度12 g/L。重復試驗三次，試驗結果為，優(yōu)化條件下GABA 產量為6.55±0.09 g/L，與預測接近，且GABA 產量與屎腸球菌單菌發(fā)酵（3.67 g/L）相比，提高到1.78 倍。

2.3 GAD 酶活力分析結果

在最優(yōu)條件下，分析不同時間以及不同發(fā)酵體系中微生物GAD 酶活力（圖5A）與GABA 產量（圖5B）的關聯。GAD 為催化L-MSG 生成GABA 的限速酶[31]，因此GAD 酶活力的檢測對于研究GABA的合成能力尤為重要。由圖5A 可知，GAD 酶活隨時間變化表現為先顯著增加后逐漸降低的趨勢，在12 h 時共發(fā)酵體系酶活達到最高，為1.14 U，此時屎腸球菌和釀酒酵母單菌發(fā)酵分別為0.84 U 和0.01 U，且發(fā)酵12 h 后，共發(fā)酵體系GAD 酶活顯著高于單菌發(fā)酵體系。由圖5B 可知，共發(fā)酵中GABA 產量顯著高于單菌發(fā)酵。以上結果表明，共發(fā)酵中GABA產量的顯著提高與GAD 酶活的顯著增強緊密相關。

圖5 谷氨酸脫羧酶（GAD）酶活力與GABA 產量測定結果Fig.5 The result of glutamate decarboxylase （GAD） activity and GABA yield

2.4 添加CFS 對GABA 產量的影響

有研究表明乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵環(huán)境中能夠通過生物膜包被、群體感應或營養(yǎng)代謝產物交換等方式進行相互作用，從而影響發(fā)酵進程[32?33]。本研究通過分別添加CFS 探究是否存在營養(yǎng)代謝產物交換的相互作用影響菌株產GABA，結果見圖6。結果表明，添加屎腸球菌AB157 CFS 和共發(fā)酵CFS 后，釀酒酵母SC-125 發(fā)酵產GABA 分別為0.18 g/L 和0.17 g/L，高于對照組的0.13 g/L；添加釀酒酵母SC-125 的CFS 后，屎腸球菌AB157 發(fā)酵產GABA 為4.61 g/L，高于對照組的3.77 g/L，但添加共發(fā)酵的CFS 后，對其產GABA 無顯著影響，具體原因有待進一步研究。上述表明，屎腸球菌AB157 或釀酒酵母SC-125 的CFS 對GABA 產量提升有幫助，其具體作用機制接下來將進一步深入研究。

圖6 添加CFS 對GABA 產量的影響Fig.6 Effect of adding CFS on GABA yield

3 結論

本試驗研究產GABA 屎腸球菌AB157 和釀酒酵母SC-125 采用共發(fā)酵提高GABA 產量，及分析相互作用和關鍵酶GAD。采用單因素和響應面分析法優(yōu)化共發(fā)酵條件，確定在總接種量為2%（V/V）的共發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度35 ℃、屎腸球菌AB157和釀酒酵母SC-125 的接種比例5:1（V/V）、底物濃度12 g/L，發(fā)酵時間96 h，此時，GABA 產量為6.55 g/L，與屎腸球菌單菌發(fā)酵相比，產量提高到1.78倍；高產GABA 機制研究表明，共發(fā)酵體系的高GAD酶活及菌株發(fā)酵代謝物的營養(yǎng)供給對GABA 的產量提高有明顯促進作用。接下來，基于屎腸球菌AB157和釀酒酵母SC-125 共培養(yǎng)高產GABA 的相互作用，對其具體互作機制將進行深入研究。