三葉青HPLC指紋圖譜研究及多成分含量測定

李士敏，劉京驊，楊穎欣，孫崇魯，張煜炯

(浙江藥科職業(yè)大學(xué)，浙江 寧波 315100)

三葉青(TetrastlgmahemsleyanumDiels et Gilg.)為葡萄科崖爬藤屬，是我國特有草本植物，2018年2月入選新“浙八味”，成為重點培育品種。中醫(yī)學(xué)認為三葉青具有清熱解毒、活血止痛等功效，內(nèi)服對小兒高熱驚厥、肝炎、扁桃體炎等療效顯著；外用可治毒蛇咬傷、跌打損傷等[1]。三葉青作為民間用藥，目前尚未被國家標(biāo)準(zhǔn)收錄，但浙江省中藥飲片炮制規(guī)范(2015年版)將其收載，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中將浸出物含量作為定量質(zhì)量控制指標(biāo)。

有研究報道，三葉青中富含黃酮、多酚、多糖、有機酸類等，以及Mg、Fe、Mn等多種微量元素[2-7]。目前針對三葉青質(zhì)量評價的研究主要集中于黃酮類或酚酸類成分的含量測定[8-10]，而對不同種類化學(xué)成分、不同產(chǎn)地三葉青的質(zhì)量比較研究較少。當(dāng)前，指紋圖譜結(jié)合多組分含量測定方法已廣泛應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制、來源分析及差異標(biāo)記物篩選等方面[11-13]。基于此，本研究采用HPLC法，建立三葉青HPLC特征指紋圖譜，并對其中山柰酚(KA)、紫云英苷(AS)、槲皮素(QU)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(KR)(黃酮類)、綠原酸(CA)(有機酸類)、白藜蘆醇(RE)(多酚類)以及虎杖苷(PO)(醌類)等7種活性成分含量進行測定，為三葉青藥材質(zhì)量控制指標(biāo)的建立與整體質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試劑

儀器：Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水儀(美國CASCADA公司)；萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)。

試劑：甲醇、乙腈(HPLC級，美國TEDIA公司)；CA(含量≥99.4%，批號：20100210)、AS(含量≥98.0%，批號：20022087)、PO(含量≥99.8%，批號：20100216)、RE(含量≥99.9%，批號：20021134)、KR(含量≥98.0%，批號：20100411)、QU(含量≥98.5%，批號：18022608)、KA(含量≥98.0%，批號：18100261)7種對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；三葉青樣品產(chǎn)于云南、貴州、重慶、湖南、廣西、浙江和福建等地(樣品信息見表1)，所有樣品經(jīng)浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校彭昕博士鑒定為葡萄科崖爬藤屬三葉青(TetrastlgmahemsleyanumDiels et Gilg.)的塊根。

表1 不同產(chǎn)地三葉青樣品信息

2 方法

2.1 樣品溶液制備

精密稱取樣品粉末(過60目篩)1.0 g，加甲醇(80%，V/V)25 mL，超聲(300 W，40 ℃)提取60 min，濾過，濾渣用同濃度甲醇25 mL重復(fù)提取1次，合并提取液，水浴濃縮至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取7種對照品適量，用甲醇溶解，制得CA濃度為1.06 mg/mL，PO濃度為1.21 mg/mL，KR濃度為5.4 mg/mL，AS濃度為2.36 mg/mL，RE濃度為0.62 mg/mL，QU濃度為8.3 mg/mL，KA濃度為0.89 mg/mL的混合溶液。置于4 ℃冰箱中保存，備用，臨用前經(jīng)0.45 μm濾膜濾過。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18柱；流動相組成為A相：乙腈，B相：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0 min，10%乙腈；0～30 min，10%～30%乙腈；30～40 min，30%～95% 乙腈；40～45 min，95%乙腈；45～60 min，95%～10%乙腈；流速：0.8 mL/min；檢測波長320 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。上述條件下，CA、PO、KR、AS、RE、QU、KA等7種成分分離良好(見圖1)。

注：1.綠原酸；2.虎杖苷；3.山柰酚-3-O-蕓香糖苷；4.紫云英苷；5.白藜蘆醇；6.槲皮素；7.山柰酚。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 重復(fù)性試驗 按“2.1”項下方法制備樣品 6 份，按“2.3”項下色譜條件測定CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面積，計算其峰面積的RSD分別為1.5%、1.1%、1.6%、1.8%、1.6%、1.3%、0.94%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 按“2.1”項下方法制備供試品溶液。在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”項下色譜條件測定CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面積，7種活性成分峰面積的RSD分別為1.9%、1.4%、1.5%、1.6%、1.5%、1.5%、1.8%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 精密度試驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件重復(fù)進樣6 次，記錄CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面積，結(jié)果7種對照品峰面積的RSD分別為1.0%、0.9%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.0%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下制備的對照品溶液適量，用甲醇稀釋至不同倍數(shù)，搖勻，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件進行測定，以混合對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，測得的峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 7 種成分的線性關(guān)系及線性范圍

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的三葉青樣品粉末1.0 g，平行6份，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，精密加入“2.2”項下的混合對照品溶液適量，按“2.3”項條件測定。計算平均回收率(見表3)，結(jié)果表明方法加樣回收率良好。

表3 回收率試驗結(jié)果

2.4.6 含量測定 按“2.1”項下方法制成供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.3”項條件測定，含量測定結(jié)果見表4。

表4 13批三葉青藥材中7 種成分的質(zhì)量分數(shù) (n=2)

2.5 三葉青HPLC 指紋圖譜分析

2.5.1 HPLC-UV特征圖譜建立 將13 批三葉青樣品，按“2.1”項下方法，制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定，記錄色譜，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(國家藥典委員會2012版)，選定S-1號樣品色譜為參照圖譜，設(shè)定時間漂移值為0.1，采用平均數(shù)法譜峰多點矯正生成三葉青對照圖譜，疊加圖譜及對照圖譜(見圖2)，將該對照圖譜的相似度值定為1，計算不同產(chǎn)地樣品特征圖譜的相似度。

圖2 不同產(chǎn)地三葉青HPLC指紋圖譜

2.5.2 共有峰的確認與歸屬 對色譜圖進行整體分析，共標(biāo)識出17個共有峰，共有峰的峰面積之和大于85%。對照確認對照品出峰時間，確定其中2號峰為CA，10號峰為PO，11號峰為KR，12號峰為AS，14號峰為RE，15號峰為KA。

2.5.3 相似度分析 將13批三葉青樣品與生成的對照指紋圖譜相比較，各批次三葉青樣品的相似度在0.537～0.986之間，樣品S3、S5、S10、S12相似度在0.8以下；樣品S4、S6相似度在0.9以下；其余樣品相似度在0.9以上。見表5。

表5 13 批三葉青相似度分析結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

流動相組成：考察甲醇、乙腈和水不同組合洗脫下的分析結(jié)果，結(jié)果顯示乙腈與水組成的流動相洗脫效果更好，得到的色譜圖色譜峰數(shù)目最多。當(dāng)在水相中加入少量磷酸后，色譜峰分離效果變得更好，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液按梯度洗脫時，基線波動較緩，各成分色譜峰保留時間適中且數(shù)量最多。故流動相組成確定為乙腈-0.1%磷酸水溶液。

檢測波長選擇：7種對照品溶液均為無色，故實驗采用DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描發(fā)現(xiàn)，7種對照品溶液在320 nm波長下測定吸光度最大，且在此波長下供試品溶液的色譜峰數(shù)目最多，因此選擇320 nm作為檢測波長。

3.2 樣品含量測定結(jié)果及分析

含量測定結(jié)果顯示，三葉青中7種活性成分含量差異較大，AS含量在0.010～0.097 mg/g之間，QU含量在0.004～0.266 mg/g之間，KR含量在0.039～0.929 mg/g之間，CA含量在0.010～0.143 mg/g之間，RE含量在0.003～0.129 mg/g之間，KA含量在0.001～0.046 mg/g之間，PO含量在0.001～ 0.065 mg/g之間?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，AS有抗炎、抗氧化和保護心肌的功能[14]。QU具有抗抑郁、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、免疫抑制、神經(jīng)保護等多種藥理學(xué)活性[15]。KA及其衍生物KR具有抗炎、抗氧化、抗驚厥、抗抑郁、抗癡呆，以及對缺血腦組織的保護作用等多種生物學(xué)活性，而其神經(jīng)保護作用尤為關(guān)注[16]。CA具有抗炎、抗氧化、抗微生物等多種生物活性[17]。PO具有抗血栓、抗動脈硬化、改善心肌損傷、抗休克以及調(diào)節(jié)糖脂代謝等多方面的藥理活性[18]。RE對非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病等代謝性疾病具有保護作用[19]。從整體看，13批樣品中，KA和PO含量較低，而KR、CA、RE和AS的含量差異較大；從單個化學(xué)成分看，三葉青中AS、QU、KR等7種化學(xué)成分的含量差異很大，這可能是受采集時間的影響所致[20]。

本研究建立了三葉青的HPLC指紋圖譜，并建立了7種活性成分的含量測定方法，可用于三葉青藥材質(zhì)量評價或其制劑質(zhì)量控制。