降糖益腎丸對(duì)糖尿病腎病大鼠腎Toll樣受體4和炎癥因子的影響

謝 瑜，楊 蕙，雷 昌，廖小娟*，王 青，聶孝平，鄒菊英，崔 姣，王艾琳

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 科技創(chuàng)新中心/湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

炎癥因子的募集和激活在促進(jìn)DN腎損傷發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著主要的介導(dǎo)作用[1]。DN患者體內(nèi)的炎癥水平隨病程進(jìn)展而加重，通過(guò)炎性介質(zhì)及炎癥信號(hào)通路介導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷并最終導(dǎo)致腎小球硬化[2]。TLR4(Toll-like receptors 4，TLR4)能識(shí)別內(nèi)源性配體并激活NF-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的合成和分泌，持續(xù)參與DN的炎癥反應(yīng)，研究表明，在DN炎癥反應(yīng)中下調(diào)TLR4可抑制JNK/NF-κB通路，減少促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1α、IL-8和TNF-α的釋放，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路及其促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)炎癥性腎損傷具有保護(hù)作用[3-4]。前期臨床研究證實(shí)，降糖益腎丸可明顯改善瘀毒損傷腎絡(luò)型DN早期患者的臨床癥狀、體征，改善尿微量白蛋白排泄率，能明顯延緩DN腎損傷的發(fā)生與發(fā)展[5]。然而降糖益腎丸治療DN的確切機(jī)制不清楚，阻礙了進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用。因此，本研究探討該藥是否通過(guò)調(diào)控腎小球細(xì)胞TLR4/NF-κB炎癥通路的表達(dá)降低DN大鼠的腎炎癥水平，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)腎小球炎癥損傷作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(300±20) g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014；飼養(yǎng)籠具、墊料、普通飼料、飲水均按SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求進(jìn)行制備與消毒，高脂高糖飼料購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司；自由攝食與飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥

降糖益腎丸(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)：20200407)。鹽酸二甲雙胍(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.25 g，批號(hào)：A2011056)，厄貝沙坦(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格0.15 g，批號(hào)：201110JB)。

1.3 儀器與試劑

AE224型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；5804R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；GA-3型血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；SE-150高速粉碎機(jī)(永康市圣象電器有限公司)。鏈脲佐菌素(STZ，S17049，18883-66-4 USP級(jí)，98.5%，上海源葉生物技術(shù)有限公司)；滅菌注射用水(石家莊四藥有限公司，批號(hào)：2005203201)，其余實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水；羧甲基纖維鈉(CMC-Na，批號(hào)：200401，安徽山河藥用輔料股份有限公司)；MB-1762B大鼠Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB p65 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號(hào)：2021053106，江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)。

1.4 動(dòng)物造模、分組及給藥

36只SD大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組30只，空白對(duì)照組6只?？瞻讓?duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)3天后，按體質(zhì)量換算后予單次腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。除空白對(duì)照組外其余大鼠給予高脂高糖飼料+飲水飽和適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，予單次腹腔注射STZ 60 mg/kg(STZ臨用前用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH=4.5，4 ℃，配制成1%STZ溶液，避光冰浴中進(jìn)行)。72 h后，尾靜脈采血，用快速血糖儀測(cè)空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG穩(wěn)定于16.7 mmol/L及以上，列入觀察對(duì)象。同時(shí)用尿糖試紙測(cè)定尿糖，尿糖強(qiáng)陽(yáng)性，繼續(xù)給予高脂高糖飲食8周，24 h尿蛋白定量≥30 mg/dL/24 h，即提示糖尿病腎病造模成功[6-7]。

造模成功后大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只：DN模型組、DN模型+降糖益腎丸組(高劑量組)、DN模型+降糖益腎丸組(中劑量組)、DN模型+降糖益腎丸組(低劑量組)、DN模型+鹽酸二甲雙胍+厄貝沙坦組。分組后開始給藥，每日定時(shí)灌胃1次，空白對(duì)照組、DN模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥4周。降糖益腎丸按成人等效劑量換算成大鼠每日灌胃劑量為低劑量組(1.35 g/kg/d)、中劑量組(2.7 g/kg/d)、高劑量組(5.4 g/kg/d)。陽(yáng)性藥鹽酸二甲雙胍180 mg/kg/d、厄貝沙坦27 mg/kg/d。各組大鼠均于相應(yīng)給藥4周后收集血清、腎組織樣本保存，備用。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束后，分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行血液采集，血漿注入含有10%乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉的離心管里，混勻后在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上層血清樣品于-80 ℃冰箱中保存，備用。取血后處死各組大鼠，于冰上摘取腎臟，剝離腎包膜，濾紙吸干血跡后，將各腎樣本取出切割，分別稱取適量，進(jìn)行冰浴上勻漿；3 000 r/min低溫離心15 min，收集上清，分裝后一份待檢測(cè)，其余用液氮迅速冷凍，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.5.1 血清炎性因子IL-6和TNF-α的含量檢測(cè) 將各組大鼠血樣取出靜置，解凍融化后保持 2～8 ℃的溫度，3 000 r/min離心15 min，取上層血清轉(zhuǎn)移，分裝備用。檢測(cè)嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.2 腎TLR4、NF-κB p65的含量檢測(cè) 將各組大鼠腎樣本取出切割后，分別稱取1 g，選用組織勻漿器，加9 mL的勻漿液來(lái)進(jìn)行冰浴上勻漿(0.1 g/mL)。勻漿液選取PBS(pH=7.2～7.4，濃度為0.01 mol/L)；3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，分裝后待檢測(cè)。檢測(cè)嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)各組相應(yīng)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；方差齊者采用LSD(L)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差不齊者用Tamhane檢驗(yàn)，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組與中、高劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)均顯著下降，低劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)亦下降(P<0.01或P<0.05)。與中、高劑量組比較，低劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與陽(yáng)性藥組比較，中、高劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)亦升高，低劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)比較

2.2 各組大鼠腎TLR4和NF-κB p65表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組與中、高劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)均顯著下降，低劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)亦下降(P<0.01)。與中、高劑量組比較，低劑量組TLR4、NF-κB p65表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與陽(yáng)性藥組比較，中、高劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)亦升高，低劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腎TLR4和NF-κB p65表達(dá)比較

3 討論

DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，消渴日久，熱灼津虧，傷陰耗氣，氣陰兩虛。氣虛血運(yùn)無(wú)力則澀滯，滯而成瘀，氣血失調(diào)致氣陰更虛，血脈更瘀。血瘀內(nèi)阻，阻礙三焦水道運(yùn)行[8]?！稘?jì)生方》言：“消渴之疾，皆起于腎?！蹦I居下焦，水濕內(nèi)聚，濕邪重濁黏膩，易于化熱，明代醫(yī)家吳昆在《醫(yī)方考》中云：“下焦之病，責(zé)于濕熱?！彼疂癫换?，焦灼津液，津液失于運(yùn)化，瘀血內(nèi)生，瘀阻腎絡(luò)。久瘀腎絡(luò)膠結(jié)化毒，毒邪阻絡(luò)，瘀毒互結(jié)內(nèi)蘊(yùn)，毒邪傷絡(luò)，毒損腎絡(luò)[9]。因此，DN基本病機(jī)為“虛、瘀、毒”，以益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒論治。本研究采用降糖益腎丸(本院制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：湘藥制字Z20080821)以化瘀解毒為重要治則，控制DN癥狀療效確切，在多年臨床應(yīng)用中無(wú)不良反應(yīng)，安全性高。方中生地、山藥益氣養(yǎng)陰，為本方之君藥；丹參、丹皮活血化瘀，黃芩、黃連除濕清熱解毒，均為臣藥，配合君藥以活血化瘀、泄?jié)峤舛?；諸藥合用，通過(guò)對(duì)人體氣血津液的調(diào)整而達(dá)到“陰平陽(yáng)秘”，共奏益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒之功[5]。瘀毒損傷腎絡(luò)貫穿DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程始終，早期表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管數(shù)量增加，GECs數(shù)量增多、腫脹、功能受損，導(dǎo)致血管滲透性增加，血漿蛋白漏出，與腎絡(luò)受損的中醫(yī)理論相符合[10]。炎性因子屬中醫(yī)“毒邪”范疇[11]。DN“毒”的特征性為腎組織內(nèi)高度表達(dá)的單核細(xì)胞趨化因子、NF-κB等細(xì)胞因子的變化，與中醫(yī)學(xué)提到的消渴病日久不愈、臟腑功能失調(diào)，導(dǎo)致瘀、熱、濕等病理產(chǎn)物瘀阻血脈而成的“毒”具有相似性[12]。

本研究采用的降糖益腎丸所含丹參藥味能有效降低高糖誘導(dǎo)大鼠腎細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)，下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路并降低下游相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)，對(duì)糖尿病狀態(tài)下的大鼠腎組織有保護(hù)作用[13]。方中黃連能降低鏈脲佐菌素(STZ)所致DN模型大鼠的糖化血紅蛋白、血清TNF-α含量，抑制腎臟NF-κB表達(dá)及增強(qiáng)過(guò)氧化物酶增殖物受體-γ(PPAR-γ)mRNA表達(dá)緩解糖尿病腎臟病變[14-15]。方中君藥生地的主要有效成分環(huán)烯醚萜苷梓醇可緩解DN的蛋白尿，通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/MyD88和p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑阻止NF-κB活化，改善炎癥損傷[16]。

綜上所述，以化瘀解毒為重要治則的降糖益腎丸治療瘀毒損傷腎絡(luò)型DN有效，能顯著降低DN大鼠的腎炎癥水平，其作用可能與下調(diào)TLR4和NF-κB p65、IL-6、TNF-α等炎性因子表達(dá)相關(guān)。