金花茶葉提取物體內(nèi)祛痰、抗炎作用及其機(jī)制研究

曾英港，陳輝華，鐘益寧，2*，李麗娟，李 玲，蔡秀琳

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530200；2.玉林師范學(xué)院，廣西 玉林537000)

金花茶(Camelliachrysantha(Hu) Tuyama)為山茶科山茶屬，是一種小型常綠喬木，高2～5 m[1]。金花茶物種較多集中在廣西，我國云南、肇慶、四川、貴州等地也有分布和栽培，其中，廣西防城港還將金花茶定為“市花”。其葉和花均是傳統(tǒng)壯藥，《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]對其有收錄記載，金花茶可以藥食兩用，被開發(fā)成許多高附加值產(chǎn)品應(yīng)用到保健養(yǎng)生、美容護(hù)膚、食品添加等多個方面。

目前金花茶葉的研究方向主要涵蓋藥材鑒定、藥材栽培、化學(xué)成分鑒定、含量成分測定、藥理活性研究等方面，而藥理作用研究主要集中在抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗菌和抗過敏等方面[3-4]。因地域局限，國外對其研究較少。據(jù)《中華本草》[5]《現(xiàn)代本草綱目》[6]記載，金花茶葉具有清熱解毒、止痢的功效，治療咽喉炎、高血壓、便血、月經(jīng)不調(diào)等也有一定效果。本研究探討金花茶葉醇提取物的祛痰和抗炎活性作用及其可能機(jī)制，以期為今后金花茶的開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)，為研發(fā)防治或改善呼吸系統(tǒng)炎癥的創(chuàng)新藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.1.2 藥品與試劑 金花茶葉(防城港市防城港區(qū)農(nóng)場)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室滕建北教授鑒定為山茶科山茶屬金花茶(Camelliachrysantha(Hu) Tuyama)的干燥葉；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：170768)；急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號：18100110)；生理鹽水(廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號：R18050804)；苯酚紅(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20180927)；二甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司，批號：1902222)；角叉菜膠(上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：9000-07-1)；酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢基因美科技有限公司，批號：JYM0531Mo、JYM0554Mo、JYM0218Mo、JYM0012Mo)；95%乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2017112301)；甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司，批號：1902222)；濃氨水(成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)，批號：2015012001)。

1.1.3 儀器 HH-S4電熱恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)；電子天平(瑞安市英衡電器有限公司)；SQP分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；UV-1780紫外分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司)；WH-2000超聲波霧化器(廣東粵華醫(yī)療器械廠)；酶標(biāo)儀(Tecan公司)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(韶關(guān)市科力實驗儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金花茶葉醇提取物的制備 選取適量金花茶葉，分別用70%、60%、50%乙醇溶液80 ℃依次水浴回流提取3次，每次1 h，合并過濾、濃縮，將濃縮液定容，得到醇提取物儲備液。使用時，稀釋得到濃度分別為20 mg/mL、60 mg/mL、100 mg/mL的金花茶葉醇提取物溶液。

1.2.2 陽性組溶液的制備 取地塞米松片12片(0.75 mg/片)研磨成細(xì)粉，用生理鹽水溶解，得到濃度為0.2 mg/mL的地塞米松溶液。

1.2.3 祛痰實驗 ①酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取酚紅5.000 mg，加入氫氧化鈉溶液溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶用5%碳酸氫鈉溶液進(jìn)行稀釋，定容，制得50 μg/mL酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別精密吸取酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，充分搖勻，選取其中1個樣品，以紫外分光光度計對其進(jìn)行掃描，記錄λmax，并在λmax處測定5個樣品的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，酚紅濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線。②酚紅排泌實驗：取SPF級昆明種小鼠，每只體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組 12只，即空白組、陽性組(急支糖漿組)、金花茶葉醇提物的低、中、高劑量組。連續(xù)灌胃給藥7 d，采用酚紅排泌法[7]，末次給藥0.5 h后，對小鼠腹腔內(nèi)注射5%酚紅溶液2 mL，0.5 h后，剝離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，加入0.9%生理鹽水2 mL、1 mol/L NaOH 0.1 mL浸泡1 h，再超聲10 min，離心3 min，3 000 r/min，取上層清液于559 nm測定其吸光度值，計算出小鼠氣管中酚紅的含量。

1.2.4 抗炎實驗 ①耳腫脹實驗：參考文獻(xiàn)[8]，取SPF級昆明小鼠，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分為5組，每組12只，即提取物低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.5 g/kg、2.5 g/kg)，陽性組(地塞米松組5 mg/kg)，空白組。除空白組給予蒸餾水，其他組給予相應(yīng)藥物。連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥0.5 h后，用二甲苯涂抹小鼠右耳，40 μL/只，1 h后將每組小鼠脊椎脫臼處死，用8 mm耳片打孔器在同一部位處打出小鼠的左、右耳片，精密稱重小鼠耳片重量，算出抑制率。計算公式：耳腫脹度=右耳片的重量-左耳片的重量；抑制率=(空白組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/空白組腫脹度均值×100%。②足腫脹實驗：小鼠分組、給藥方法同“耳腫脹實驗”，參考文獻(xiàn)[8]。末次給藥1 h后，在小鼠右足趾同一部位(右后足朝向踝關(guān)節(jié)方向)皮下注射0.1 mL 的1.0% 角叉菜膠溶液，用于制造炎癥模型，并于致炎后再灌胃給予相應(yīng)藥物1次，觀察小鼠足趾腫脹程度，4 h后將每組小鼠脊椎脫臼處死，用剪刀沿踝關(guān)節(jié)剪下兩足，并精密稱量各組小鼠足趾質(zhì)量，計算抑制率。計算公式：足腫脹度=右足質(zhì)量-左足質(zhì)量；抑制率=(空白組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/空白組腫脹度均值×100%。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗 參考文獻(xiàn)[9]，分組給藥方式與“1.2.4”項下相同，每天灌胃給藥2次，連續(xù)14 d，末次給藥1 h后，除了空白組，精密吸取300 μL二甲苯溶液涂抹在其余組小鼠右側(cè)的腹部和背部，同時將0.4% 醋酸溶液進(jìn)行腹腔注射，0.2 mL/只，用于制造炎癥模型。在致炎3 h后眼球取血，將血液全部收集在2.5 mL的離心管中。將血液樣品進(jìn)行離心20 min，3 000 r/min，取上清按ELISA試劑盒說明書的操作步驟，對血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A進(jìn)行含量測定，若樣品出現(xiàn)沉淀，需要離心后再進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 金花茶葉醇提取物對小鼠的祛痰作用

得到的酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.183 2x+0.016 11，R2=0.999 8，其中y為吸光度值，x為酚紅溶液的濃度(μg/mL)。與空白組比較，金花茶葉醇提取物各劑量組小鼠氣管酚紅的排泌量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且急支糖漿組酚紅的排泌量少于高劑量組。結(jié)果見表1。

表1 金花茶葉醇提取物祛痰作用結(jié)果

2.2 金花茶葉醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹作用

涂抹二甲苯溶液后，觀察各組小鼠的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)每組小鼠耳朵都有不同程度的腫脹，且部分小鼠的耳朵血管變紅，清晰可見。與空白組比較，地塞米松組、提取物各劑量組均能夠顯著抑制二甲苯引起的耳腫脹(P<0.01)。隨著金花茶葉醇提取物的劑量增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)，且中、高劑量組優(yōu)于地塞米松組。具體結(jié)果見表2。

表2 金花茶葉醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹作用結(jié)果

2.3 金花茶葉醇提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹作用的影響

皮下注射角叉菜膠后，發(fā)現(xiàn)每組小鼠足部都有不同程度的水腫，隨著時間推移，小鼠足部越來越腫，在第4 h時，小鼠的足腫脹程度最為明顯，5 h后足腫脹度逐漸變小。與空白組比較，地塞米松組、低、中、高劑量組均能夠抑制小鼠足腫脹(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組的抑制作用和地塞米松組相當(dāng)。具體結(jié)果見表3。

表3 金花茶葉醇提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹作用結(jié)果

2.4 金花茶葉醇提物對致炎小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量的影響

空白組與模型組比較(表4)，小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A的含量水平顯著增加(P<0.01)，說明通過使用二甲苯溶液和醋酸溶液造模后，小鼠血清中的炎癥細(xì)胞因子含量增高，致炎成功。提取物各劑量組和模型組比較，低、中、高劑量組能夠顯著抑制TNF-α的含量(P<0.01)，同時，中、高劑量組能顯著減少IL-17A、IL-1β的含量，高劑量組能夠有效減少IL-6的含量。

表4 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量結(jié)果

3 討論

酚紅排泄法是藥理實驗中一種用于篩選祛痰藥物的可靠實驗方法。痰液作為由肺泡、氣管和支氣管分泌出來的黏液，是引起咳嗽的一個重要因素。當(dāng)其分泌量增多時，可減少對呼吸道黏膜的刺激，從而起到止咳作用。二甲苯致耳腫脹以及角叉菜膠致足腫脹都屬于急性炎癥模型，能夠復(fù)制化學(xué)因子引起的炎癥模型，常用于篩選和評價藥物的抗炎作用。與炎癥相關(guān)細(xì)胞因子可分為兩類：一是促炎因子，包括 IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、INF-γ、TNF-α等，二是抗炎因子，主要有IL-4、IL-10等[12]。炎癥是在各種損傷因素作用下產(chǎn)生大量促炎因子、減少抗炎因子的結(jié)果。機(jī)體產(chǎn)生的抗炎因子，能防止炎癥反應(yīng)的損傷，可促進(jìn)組織修復(fù)、對抗促炎因子的作用。

金花茶為廣西壯族傳統(tǒng)藥食資源，相關(guān)文獻(xiàn)記載金花茶可用于治療咽喉炎、腎炎等癥。且TANWAR A等[10]研究證實，茶的乙醇提取物有相當(dāng)好的抗炎作用。閻新佳[11]研究發(fā)現(xiàn)金花茶葉醇提物對內(nèi)毒素介導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞炎癥損傷具有保護(hù)作用。但關(guān)于金花茶葉體內(nèi)的抗炎作用未見文獻(xiàn)報道，其祛痰藥理研究幾乎空白。本課題首次采用酚紅排泌法以及耳、足腫脹法研究金花茶葉醇提取物的祛痰以及抗炎活性，并用ELISA法評價小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量，探討其發(fā)揮抗炎作用的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)提取物3個劑量組對小鼠氣管痰液分泌均具有一定促進(jìn)作用，能夠增加酚紅的排泌量，對二甲苯、角叉菜膠局部引起的小鼠耳、足腫脹都具有明顯緩解效果(P<0.05)，且高劑量組均優(yōu)于陽性對照組，表明金花茶葉醇提取物具有較好的祛痰作用。金花茶葉具有豐富的黃酮類成分以及茶多酚類成分，猜測該類成分可能是祛痰、抗炎的藥效成分之一，仍有待進(jìn)一步實驗證實。在ELISA實驗中，金花茶葉醇提取物能夠減少小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的含量水平(P<0.05)，表明金花茶葉的抗炎機(jī)制可能是通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的形成，減少細(xì)胞損傷從而保證機(jī)體細(xì)胞正常運行而發(fā)揮作用，起抗炎作用的具體化學(xué)成分及其作用特點還有待后續(xù)進(jìn)一步探討。

二甲苯致小鼠耳腫脹實驗的難點在于二甲苯溶液具有毒性且具有揮發(fā)性，涂抹小鼠耳朵時可能會不均勻，對小鼠耳朵造成不同程度的腫脹。涂抹二甲苯時，需要精密吸取，控制環(huán)境溫度等減少二甲苯的揮發(fā)。在角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗中，剪取小鼠足部時需剪取一致的部位，同時，注射小鼠足趾部位、注射角叉菜膠的用量應(yīng)一致。ELISA實驗的難點在于，給小鼠眼球取血時要避免出現(xiàn)溶血的情況，并且成功分離出較多的血清，在測定細(xì)胞因子含量時，避免出現(xiàn)點樣錯誤或者稀釋錯誤，并在規(guī)定時間內(nèi)完成反應(yīng)、含量檢測。

4 結(jié)論

金花茶葉具有良好的祛痰作用，起作用的藥效成分以及作用機(jī)制有待深入研究，同時實驗結(jié)果也表明，金花茶葉具有良好的抗炎作用，抗炎機(jī)制可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的合成及釋放有關(guān)。本研究可為金花茶葉的臨床應(yīng)用及其治療物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，而且具有較好的開發(fā)價值，至于其有效成分以及藥效機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。